周明寬　張亞東　呂坤龍　莊錦濤　鄧春華　涂響安

510080 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科

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勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體周細(xì)胞數(shù)量和微血管密度變化的研究

周明寬張亞東呂坤龍莊錦濤鄧春華涂響安

510080 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科

【摘要】目的檢測(cè)勃起功能障礙(ED)大鼠模型陰莖海綿體周細(xì)胞數(shù)量(PN)和微血管密度(MVD)變化。方法構(gòu)建高脂血癥ED大鼠模型(ED組)，檢測(cè)勃起狀態(tài)下海綿體內(nèi)壓(ICP)變化，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)陰莖海綿體PN和MVD，并比較其與正常大鼠(正常對(duì)照組)的差異。結(jié)果大鼠陰莖海綿體周細(xì)胞主要分布在陰莖海綿體靠近白膜的微血管部分。勃起狀態(tài)下ED組大鼠ICP為(21.0±1.5)mm Hg，低于正常對(duì)照組大鼠的(36.3±5.7)mm Hg(P<0.01)。ED組大鼠陰莖海綿體的PN為(7.13±1.82)個(gè)，少于正常對(duì)照組的(8.89±2.24)個(gè)(P<0.01)，2組大鼠的MVD比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論陰莖海綿體周細(xì)胞可能與陰莖海綿體勃起的血流調(diào)控過程有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】勃起功能障礙；海綿體；周細(xì)胞；數(shù)量

勃起功能障礙(ED)是指陰莖不能達(dá)到或維持足夠的勃起硬度以完成滿意的性生活，是男科的常見病和多發(fā)病。陰莖海綿體是主要的勃起器官，有豐富的動(dòng)、靜脈血管分布。近年研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、高血壓病、高脂血癥等與ED的發(fā)生密切相關(guān)，血管內(nèi)皮功能障礙是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[1]。另有報(bào)道，對(duì)于微血管血流量的調(diào)控，除內(nèi)皮細(xì)胞外，包括微血管周細(xì)胞在內(nèi)的血管周圍細(xì)胞在微血管系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。周細(xì)胞是位于微血管(微動(dòng)脈、毛細(xì)血管、微靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞外的壁細(xì)胞[3]。研究認(rèn)為，周細(xì)胞參與血腦屏障功能、血流調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)、纖維化和血管再生等多種病理生理過程的調(diào)節(jié)，在泌尿生殖系統(tǒng)病理生理過程如腎臟纖維化、腎血流調(diào)節(jié)、腎小球?yàn)V過等也有一定的調(diào)節(jié)作用[4-5]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)(免疫組化)法檢測(cè)陰莖海綿體中周細(xì)胞數(shù)量(PN)和微血管密度(MVD)，并比較不同疾病狀態(tài)下PN和海綿體內(nèi)壓(ICP)的變化，探討周細(xì)胞對(duì)陰莖海綿體勃起過程中血流調(diào)控的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體級(jí)成年雄性SD大鼠10只，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理符合中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

二、主要試劑

實(shí)驗(yàn)用抗體：兔源多克隆抗大鼠CD31(Abcam，美國(guó))，兔源多克隆抗大鼠血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-β(PDGFR-β，Santa，美國(guó))，小鼠源單克隆抗大鼠α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA，武漢博士德)，二抗為超敏型二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋)。所有抗體均采用含5%山羊血清和0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。

三、方法

1. 高脂血癥ED大鼠模型的建立及鑒定

大鼠適應(yīng)性喂飼1周后，隨機(jī)分成ED組和正常對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組各5只。ED組喂飼高脂飼料(普通飼料+15%食用油+6%膽固醇+2%膽酸鈉+10%蔗糖+0.2%丙基硫氧嘧啶)制作高脂血癥動(dòng)物模型，正常對(duì)照組喂飼普通飼料；2組大鼠均正常自由飲水。每日觀察大鼠活動(dòng)情況，每周稱量體質(zhì)量和測(cè)量體長(zhǎng)，記錄進(jìn)食量和飲水量。飼養(yǎng)周期30 d。30 d后，禁食12 h，再次稱量體質(zhì)量和測(cè)量體長(zhǎng)；腹腔注射水合氯醛麻醉，眼底靜脈叢采血，采用酶法分別檢測(cè)血清總膽固醇和甘油三酯。

2. 大鼠陰莖ICP測(cè)定

ICP的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[6]，即大鼠經(jīng)4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，取下腹部正中切口，充分暴露陰莖及球海綿體肌，并解剖暴露陰莖背神經(jīng)。將充滿肝素鹽水的25 G針頭插入一側(cè)陰莖海綿體，針的另一端連接壓力傳感器，固定針頭和陰莖。記錄大鼠的基礎(chǔ)ICP，電刺激陰莖背神經(jīng)誘發(fā)勃起，測(cè)定勃起后的ICP并記錄。

3. 陰莖組織的免疫組化染色檢查

大鼠麻醉固定后，剪開陰莖皮膚，完整切取陰莖海綿體，PBS漂洗去除血跡并取中段制作陰莖海綿體冠狀位連續(xù)石蠟切片。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)法。免疫學(xué)染色時(shí)，石蠟切片烤片，常規(guī)脫蠟、水化后分別對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和周細(xì)胞標(biāo)志物PDGFR-β及α-SMA進(jìn)行免疫組化染色。染色過程中抗原修復(fù)方法為高壓修復(fù)法。二氨聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片后觀察，檢測(cè)海綿體組織中CD31、PDGFR-β和α-SMA的表達(dá)并比較。

4. 海綿體PN和MVD的定量檢測(cè)

PN：陰莖海綿體免疫組化切片首先在100倍視野下選擇計(jì)數(shù)部位，然后在400倍視野下計(jì)數(shù)。每組計(jì)數(shù)5例，每例分別選取9個(gè)不重復(fù)視野計(jì)數(shù)并拍照(兩側(cè)陰莖海綿體各4個(gè)，中間連接部1個(gè))，然后計(jì)算單位視野(400倍)平均PN，即PN。

MVD：陰莖海綿體免疫組化切片首先在100倍視野下選擇計(jì)數(shù)部位，然后在400倍視野下計(jì)數(shù)，單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞作為1個(gè)計(jì)數(shù)單位，殘存血管或管腔直徑>8個(gè)紅細(xì)胞者不計(jì)數(shù)。每組計(jì)數(shù)5例，每例分別選取9個(gè)不重復(fù)視野計(jì)數(shù)并拍照(兩側(cè)陰莖海綿體各4個(gè)，中間連接部1個(gè))，然后計(jì)算單位視野(400倍)平均微血管數(shù)量，即MVD。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、大鼠陰莖ICP測(cè)定

大鼠喂飼30 d后，ED組大鼠體質(zhì)量、血清總膽固醇和甘油三酯水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)，見表1。大鼠麻醉后測(cè)量ICP，ED組與正常對(duì)照組ICP基線水平相似；電刺激陰莖背神經(jīng)誘發(fā)勃起后測(cè)量ICP，ED組平均ICP高于正常對(duì)照組(P<0.05)，表明ED組制模成功，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1　ED組和正常對(duì)照組大鼠各指標(biāo)水平比較±s)

圖1　ED組和正常對(duì)照組大鼠ICP比較

A：ED組；B：正常對(duì)照組；綠色條帶為電刺激持續(xù)時(shí)間

二、陰莖海綿體周細(xì)胞和微血管免疫組化結(jié)果

大鼠陰莖海綿體冠狀位石蠟切片分別對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抗體CD31、周細(xì)胞抗體PDGFR-β和α-SMA進(jìn)行免疫組化染色，抗體抗原陽(yáng)性反應(yīng)呈棕色，3種抗體均有表達(dá)，且主要分布在陰莖海綿體靠近白膜的部分，見圖2、3。

圖2　大鼠陰莖海綿體周細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果(SP法，A、C×200，B、D×400)

A、 B：正常對(duì)照組；C、D：ED組；黑色箭頭所示為周細(xì)胞

圖3　陰莖海綿體微血管免疫組化(SP法，A、C×200，B、D×400)

A、 B：正常對(duì)照組；C、D：ED組；黑色箭頭所示為微血管

三、陰莖海綿體PN和MVD比較

ED組大鼠陰莖海綿體PN少于正常對(duì)照組(P<0.01)，2組MVD比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2　ED組和正常對(duì)照組大鼠陰莖海綿體

討論

ED是男性常見的性功能障礙之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ED與男性的年齡、身體狀況、吸煙、血糖和血脂等狀態(tài)密切相關(guān)[7]。陰莖主要由陰莖海綿體和尿道海綿體構(gòu)成，陰莖海綿體是主要的勃起器官，由小梁和血竇組成。陰莖勃起是神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)下陰莖海綿體動(dòng)脈復(fù)雜血流動(dòng)力學(xué)變化的血管調(diào)節(jié)過程：動(dòng)脈擴(kuò)張、動(dòng)脈血流量明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞分泌的內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、一氧化氮、內(nèi)皮源性超極化因子和神經(jīng)末梢釋放的去甲腎上腺素、一氧化氮及局部其他細(xì)胞釋放的多種血管活性物質(zhì)的作用下，陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和對(duì)鈣離子的敏感性發(fā)生變化，引起平滑肌細(xì)胞的收縮、舒張以及海綿體血流量的變化，陰莖勃起狀態(tài)改變[8]。

對(duì)于微血管血流量的調(diào)控，除內(nèi)皮細(xì)胞外，包括微血管周細(xì)胞在內(nèi)的血管周圍細(xì)胞在微血管系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。周細(xì)胞位于微血管內(nèi)皮細(xì)胞和基膜之間并部分包繞內(nèi)皮細(xì)胞，它通過多種途徑參與血管功能的維持和調(diào)節(jié)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，周細(xì)胞能合成細(xì)胞外基質(zhì)，當(dāng)周細(xì)胞缺乏時(shí)，微血管發(fā)育異常、管徑不規(guī)則，通透性增加[9]。周細(xì)胞通過多種信號(hào)通路，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及其受體系統(tǒng)、血管生成素及其受體、血小板生長(zhǎng)因子-β及其受體和1-磷酸-鞘氨醇及其受體等，與微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)和維持血管的穩(wěn)定性[10]。周細(xì)胞內(nèi)還含有SMA，體外試驗(yàn)可直接觀察到周細(xì)胞的收縮，因此推測(cè)周細(xì)胞可能直接參與調(diào)控微血管直徑，調(diào)節(jié)局部血流量等[11-12]。

PN因組織器官類別、生長(zhǎng)階段和疾病狀態(tài)的不同而有較大差異，其與內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量比例范圍為1∶100至1∶1，大約覆蓋10%～50%的血管內(nèi)皮層。在嚙齒動(dòng)物模型中，糖尿病發(fā)生后2個(gè)月PN開始減少，這一現(xiàn)象比無細(xì)胞毛細(xì)血管的出現(xiàn)早數(shù)月；并且無論是自然發(fā)生的糖尿病模型還是藥物誘導(dǎo)的動(dòng)物模型，視網(wǎng)膜PN均從2～3個(gè)月時(shí)開始減少，實(shí)驗(yàn)6個(gè)月時(shí)，PN減少了15%～50%，其機(jī)制仍不清楚，推測(cè)可能與局部活性氧簇物質(zhì)、糖基化產(chǎn)物過多等導(dǎo)致周細(xì)胞的凋亡有關(guān)[13]。PN的減少會(huì)引起部分內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變：正常血管內(nèi)壁是平整光滑的，周細(xì)胞缺如的血管內(nèi)壁會(huì)出現(xiàn)較多的膜折疊，影響內(nèi)皮細(xì)胞的外形，進(jìn)而影響血管的直徑和功能[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，周細(xì)胞在大鼠陰莖海綿體中主要分布在較靠近白膜的海綿體微血管部分， ED大鼠陰莖海綿體MVD與正常對(duì)照組相近，PN較正常對(duì)照組明顯減少，而ICP測(cè)定顯示，ED大鼠陰莖ICP較正常對(duì)照組明顯降低，提示陰莖海綿體周細(xì)胞可能與陰莖海綿體勃起的血流調(diào)控過程有關(guān)，但周細(xì)胞在勃起過程中對(duì)海綿體血流調(diào)控的具體作用機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究闡明。

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Changes in pericyte number and microvascular density in corpus cavernosum of rat models with erectile dysfunction

ZhouMingkuan,ZhangYadong,LyuKunlong,ZhuangJintao,DengChunhua,TuXiang’an.

DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,ChinaCorrespondingauthor,TuXiang’an,E-mail:txabs9988@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes in the pericyte number (PN) and microvascular density (MVD) in the penile corpus cavernosum of rat models with erectile dysfunction (ED). MethodsED rat models with hyperlipidemia were established. The changes in the intracavernosal pressure (ICP) were measured under erectile status. PN and MVD of the corpus cavernosum were analyzed by immunohistochemistry and statistically compared with the normal rats (control group). ResultsThe pericytes were mainly distributed in the microvesssels adjacent to the tunica albuginea of the corpus cavernosum. Under erectile status, the mean ICP in the ED group was (21.0±1.5) mmHg, significantly lower compared with (36.3±5.7) mmHg in the control group (P<0.01). The PN in the ED group was 7.13±1.82, considerably less than 8.89±2.24 in the control group (P<0.01). The MVD did not significantly differ between the ED and control groups (P>0.05). ConclusionThe pericyte of the corpus cavernosum might be associated with the regulation of blood flow in the penile corpus cavernosum.

【Key words】Erectile dysfunction; Corpus cavernosum; Pericyte; Number

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.006

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81172432，81302223,81471449)；廣東省科技計(jì)劃對(duì)外合作項(xiàng)目(2013B51000021)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013J4500010)；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目(S2013040012294)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(A2014822, C2013022)

(收稿日期：2016-01-25)(本文編輯：林燕薇)

·基礎(chǔ)研究論著·

通訊作者，涂響安，E-mail：txabs9988@163.com