姜曉靜，孫秀柱，朱化彬，杜衛(wèi)華，郝海生，趙學(xué)明，王棟，劉巖

?

綠色熒光蛋白放射免疫分析試劑盒的研制

姜曉靜*，孫秀柱*，朱化彬，杜衛(wèi)華，郝海生，趙學(xué)明，王棟，劉巖

作者單位：100193 北京，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所（姜曉靜、朱化彬、杜衛(wèi)華、郝海生、趙學(xué)明、王棟、劉巖）；712100 陜西楊凌，西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院（姜曉靜、孫秀柱）

*同為第一作者

綠色熒光蛋白（GFP）于 1962 年在一種學(xué)名為Aequorea Victoria 的水母中發(fā)現(xiàn)，包含 238 個氨基酸殘基［1-2］。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下，會吸收藍(lán)光的部分能量，發(fā)出綠色熒光。GFP 常用于標(biāo)記某些特定的 RNA、內(nèi)源性代謝產(chǎn)物以及靶蛋白［3］，可通過熒光顯微鏡實時觀察，也可通過熒光激活細(xì)胞，分選分離細(xì)胞［4］。這一活體生物標(biāo)記［5］特性，使得 GFP 成為實時觀察細(xì)胞、組織、器官不可或缺的工具［6］，在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中也得到了廣泛的應(yīng)用［7-12］。

目前，對 GFP 的檢測方法分為定性檢測及定量檢測。定性檢測包括熒光觀察［13］、免疫組化［14-16］、Western blot等［17-19］，定量檢測可以通過 ELISA 方法。但通過 ELISA 方法定量檢測 GFP 含量［20-22］，顯色時間不容易控制，檢測靈敏度受到免疫反應(yīng)顯色精確度的限制。對于少量 GFP 殘留的檢出率低，不利于精確檢測［23］。

本實驗應(yīng)用競爭機制原理，研制了一種高靈敏度的GFP 放射免疫檢測試劑盒，最低檢測限位 1 pg/ml。本試劑盒的一抗使用濃度低，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，實驗效率高，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法，對實現(xiàn)大批量樣品的 GFP 殘留監(jiān)控具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

緩沖液 A：0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PBS）pH 7.2；緩沖液 B：1% 牛血清白蛋白、0.1% 冷海魚皮膠、0.05% 疊氮鈉、0.1 mol/L PBS pH 7.2；GFP 標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 Vector公司；綠色熒光蛋白多克隆抗體（GFP 多抗）購自美國Chemicon 公司，用 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）稀釋，稀釋比例為 1∶4000。PR 分離劑由驢抗兔二抗（1∶1000 稀釋）、6% 聚乙二醇（PEG）、γ 球蛋白、0.1 mol/L PBS（pH 7.2）組成，其中驢抗兔二抗購于北方生物技術(shù)研究所；標(biāo)準(zhǔn)品溶液為 9 個濃度梯度，分別為 1、2、4、8、16、32、64、128 和 256 pg/ml；CG-12 型 γ 計數(shù)器為美國德普公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1綠色熒光蛋白的標(biāo)記GFP 與放射性碘的結(jié)合采用氯胺-T 法進行［24］。將 5 μg GFP 溶于 100 μl 的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）中，加入約 37 mol/L MBq Na125I，磁力攪拌器下加入 15 μl 氯胺-T（1 μg/μl），反應(yīng) 1 min 后加入 5 μl 偏重亞硫酸鈉（2 μg/μl）終止反應(yīng)，繼續(xù)攪拌60 s，G-25 凝膠柱層析分離純化。反應(yīng)溫度為 20 ℃。最終得到125I-GFP 放射性活度約 20 000 cpm/100 μl。

1.2.2綠色熒光蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的配置臨用前吸取 GFP 標(biāo)準(zhǔn)品（1.024 ng/μl）1 μl，加 2 ml 緩沖液 A 溶解，濃度為512 pg/ml，作為 S10，另取試管 9 支，編號 S9～ S1，各加緩沖液 A 1 ml，從 S10中取 1 ml 加到 S9，依次倍比稀釋至 S1，S9～ S1試管的濃度分別為 256、128、64、32、16、8、4、2、1 pg/ml。

1.2.3綠色熒光蛋白放射免疫分析程序在聚苯乙烯試管上編號，包括總管（T 管）、非特異管（NSB 管）、零結(jié)合管（S0管）、標(biāo)準(zhǔn)管（S1～ S9管）、樣本管（U 管），以上試管必須雙管標(biāo)號；向 S1～ S9管加入 200 μl 標(biāo)準(zhǔn)品、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP；向 U 管加入200 μl 待測樣本、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP；向 NSB 管加入 200 μl 緩沖液 A、100 μl 緩沖液 B 及 100 μl125I-GFP；向 S0管加入 200 μl 緩沖液 A、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP；充分混勻，放置4 ℃ 24 h，每管分別加入 PR 分離劑 500 μl，充分混勻，室溫放置 20 min，4 ℃ 條件下，3500 r/min 離心 25 min，吸棄上清，測各管沉淀 cpm 數(shù)。

2　結(jié)果

本實驗采用平衡法，數(shù)據(jù)分析采用世界衛(wèi)生組織放射免疫分析推薦的 Logit 標(biāo)準(zhǔn)曲線法。標(biāo)準(zhǔn)曲線法使用的計算參數(shù)及計算過程如下：

⑴每對試管（T、NSB、S0、S1～ S9、U）的平均計數(shù)：計數(shù) = 平均 cpm - 本底計數(shù)。

⑵非特異結(jié)合率：NSB% = NSB/T × 100%

⑶最大結(jié)合率：B0% =（B0- NSB）/T × 100%

⑷各標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管結(jié)合率：

B/B0% ＝（B - NSB）/（B0- NSB）× 100%，其中 B =標(biāo)準(zhǔn)管（或樣本管）雙管技術(shù)的均值；B0= 零標(biāo)準(zhǔn)（S0）雙管計數(shù)的均值；NSB = 非特異雙管計數(shù)的均值。

以上各標(biāo)準(zhǔn)點的 B/B0為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)點濃度為橫坐標(biāo)，在 Logit-Log 雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣本的結(jié)合率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的樣品蛋白含量?；蛴勺詣?γ 計數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線上 S1、S2、S3、S4、S5及 S9樣品管的對應(yīng)自查值分別為 0.99、2.03、7.92、16.61、30.68 和 258.52 pg/ml，與實際加入濃度相符。B 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù) NSB% = 3.4%，B0/T = 51.04%，線性回歸 r = -0.99991，A = 1.65，B = -1.41，ED75= 2.45，ED50= 14.76，ED25= 89.02。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線測量數(shù)據(jù)如表1 所示。

圖1　Log-logit 雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線測量數(shù)據(jù)

試驗應(yīng)用競爭機制原理，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的 GFP 和加入的125I-GFP 共同與一定量的特異性抗體產(chǎn)生競爭性免疫反應(yīng)。125I-GFP 同抗體的結(jié)合量與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中 GFP 的含量呈一定的函數(shù)關(guān)系。用免疫分離試劑（PR）將結(jié)合部分（B）與游離部分（F）分離后，測定結(jié)合部分的放射性強度，并計算相應(yīng)結(jié)合率 B/B0。用已知標(biāo)準(zhǔn) GFP 含量與對應(yīng)結(jié)合率作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)結(jié)合率的待測樣品中 GFP 的含量。

3　討論

本試劑盒檢測靈敏度高，最低檢測限位 1 pg/ml，明顯高于商用試劑盒，如 Cell Biolabs 公司 GFP ELISA 試劑盒，靈敏度為 30 pg/ml［25-27］；Bioo Scientific 公司的 GFP ELISA 試劑盒，檢測范圍為 2 ～ 12 ng/ml［28-29］。同位素檢測靈敏度高于 ELISA 顯色反應(yīng)。

GFP 放射免疫試劑盒準(zhǔn)確性高，假陽性率低。放射免疫檢測的優(yōu)勢尤其體現(xiàn)在一些含有內(nèi)源性的酶和生物素的動物組織中，如肝臟、脾臟、腎臟。在辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素的 ELISA 體系中，內(nèi)源性的過氧化物酶或生物素會提高陰性樣本的讀值，引發(fā)假陽性的 ELISA反應(yīng)。放射免疫試劑盒由于直接用同位素標(biāo)記抗原，與樣本中抗原競爭抗體，沒有生物素、過氧化物酶體系，從根源上避免了內(nèi)源性酶及生物素的假陽性反應(yīng)，大大提高了檢測的效率。

樣品的前處理過程簡單。體液樣本、細(xì)胞培養(yǎng)液可直接用于測定；組織樣本，無論是否含有內(nèi)源性酶及生物素，前處理步驟僅需組織總蛋白提取及總蛋白定量步驟，不需要對內(nèi)源性酶及生物素進行屏蔽，減少溶液配制，精簡操作步驟，節(jié)約時間，節(jié)約勞動力。而 ELISA 試劑盒通常不包含內(nèi)源性酶及生物素抑制劑，需要使用者單獨配置。

本試劑盒測定通量高，能同時檢測大量的樣品，提高實驗效率，采用 CG-12 型 γ 放射免疫計數(shù)器可一次同時檢測 300 個試管，大大提高檢測效率。

本試驗建立一種簡便的、高靈敏度的綠色熒光蛋白放射免疫檢測方法。根據(jù)該法研制的放射免疫試劑盒檢測靈敏度為 1 pg/ml，檢測范圍為 1 ～ 256 pg/ml，一抗稀釋比例為1∶4000，可用于測定體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 GFP 蛋白表達豐度，也可用于測定轉(zhuǎn)基因動物血液、器官、組織蛋白溶液中的GFP 殘留。

參考文獻

［1］ Orm? M， Cubitt AB， Kallio K， et al. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science， 1996， 273（5280）：1392-1395.

［2］ Prendergast FG， Mann KG. Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forsk?lea. Biochemistry， 1978， 17（17）：3448-3453.

［3］ Walker CL， Lukyanov KA， Yampolsky IV， et al. Fluorescence imaging using synthetic GFP chromophores. Curr Opin Chem Biol， 2015，27：64-74.

［4］ Pinto AR， Paolicelli R， Salimova E， et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One， 2012， 7（5）：e36814.

［5］ Phillips GJ. Green fluorescent protein--a bright idea for the study ofbacterial protein localization. FEMS Microbiol Lett， 2001， 204（1）：9-18.

［6］ Nienhaus K， Nienhaus GU. Fluorescent proteins for live-cell imaging with super-resolution. Chem Soc Rev， 2014， 43（4）：1088-1106.

［7］ Tseng CL， Peng CL， Huang JY， et al. Gelatin nanoparticles as gene carriers for transgenic chicken applications. J Biomater Appl， 2013，27（8）：1055-1065.

［8］ Lin YS， Yang CC， Hsu CC， et al. Establishment of a novel，eco-friendly transgenic pig model using porcine pancreatic amylase promoter-driven fungal cellulase transgenes. Transgenic Res， 2015，24（1）：61-71.

［9］ Hong SG， Oh HJ， Park JE， et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote， 2012，20（1）：67-72.

［10］ Matsumoto T， Suetsugu A， Shibata Y， et al. A color-coded imageable syngeneic mouse model of stromal-cell recruitment by metastatic lymphoma. Anticancer Res， 2015， 35（9）：4647-4654.

［11］ Rescan PY， Ralliere C， Lebret V， et al. Analysis of muscle fibre input dynamics using a myog： GFP transgenic trout model. J Exp Biol， 2015，218（Pt 8）：1137-1142.

［12］ Kato H， Abe K， Yokota S， et al. Establishment of oct4：gfp transgenic zebrafish line for monitoring cellular multipotency by GFP fluorescence. In Vitro Cell Dev Biol Anim， 2015， 51（1）：42-49.

［13］ Loussert Fonta C， Humbel BM. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys， 2015， 581：98-110.

［14］ Huang C， Tang M， Yehling E， et al. Over expressing sonic hedgehog peptide restores periosteal bone formation in a murine bone allograft transplantation model. Mol Ther， 2014， 22（2）：430-439.

［15］ O'Sullivan ML， Martini F， von Daake S， et al. LPHN3， a presynaptic adhesion-GPCR implicated in ADHD， regulates the strength of neocortical layer 2/3 synaptic input to layer 5. Neural Dev， 2014， 9：7.

［16］ Liu Y， Wu Q， Cui H， et al. Expression of EGFP and NPTII protein is not associated with organ abnormalities in deceased transgenic cloned cattle. Cloning Stem Cells， 2008， 10（4）：421-428.

［17］ Oravcová M， Teska M， P?ta F， et al. Fission yeast CSL proteins function as transcription factors. PLoS One， 2013， 8（3）：e59435.

［18］ Hughes AJ， Spelke DP， Xu Z， et al. Single-cell western blotting. Nat Methods， 2014， 11（7）：749-755.

［19］ Aligny C， Roux C， Dourmap N， et al. Ketamine alters cortical integration of GABAergic interneurons and induces long-term sex-dependent impairments in transgenic Gad67-GFP mice. Cell Death Dis， 2014， 5：e1311.

［20］ Zhang Y， Angel CA， Valdes S， et al. Characterization of the promoter of grapevine vein clearing virus. J Gen Virol， 2015， 96（Pt 1）：165-169.

［21］ Fulton LM， Taylor NA， Coghill JM， et al. Altered T-cell entry and egress in the absence of Coronin 1A attenuates murine acute graft versus host disease. Eur J Immunol， 2014， 44（6）：1662-1671.

［22］ Baez A， Majdalani N， Shiloach J. Production of recombinant protein by a novel oxygen-induced system in Escherichia coli. Microb Cell Fact， 2014， 13（1）：50.

［23］ Fonseca JP， Steffen PA， Muller S， et al. In vivo Polycomb kinetics and mitotic chromatin binding distinguish stem cells from differentiated cells. Genes Dev， 2012， 26（8）：857-871.

［24］ Xiao L. Radio isotope technique. Beijing： Atomic Energy Press， 2000. （in Chinese）肖倫. 放射性同位素技術(shù). 北京： 原子能出版社， 2000.

［25］ Zhou W， Hildebrandt F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol， 2012， 23（6）：1039-1047.

［26］ Gee HY， Zhang F， Ashraf S， et al. KANK deficiency leads to podocyte dysfunction and nephrotic syndrome. J Clin Invest， 2015， 125（6）：2375-2384.

［27］ Vemula SV， Veerasamy R， Ragupathy V， et al. HIV-1 induced nuclear factor I-B （NF-IB） expression negatively regulates HIV-1 replication through interaction with the long terminal repeat region. Viruses， 2015，7（2）：543-558.

［28］ Colella P， Trapani I， Cesi G， et al. Efficient gene delivery to the cone-enriched pig retina by dual AAV vectors. Gene Ther， 2014， 21（4）：450-456.

［29］ Trapani I， Colella P， Sommella A， et al. Effective delivery of large genes to the retina by dual AAV vectors. EMBO Mol Med， 2014， 6（2）：194-211.

·協(xié)會之窗·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.014

基金項目：國家自然科學(xué)基金（31301977）；農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS06-2016）；西北農(nóng)林科技大學(xué)引進人才科研啟動費（Z111021203）

通信作者：劉巖，Email：liuyan05@caas.cn

收稿日期：2015-11-04