馬文瑞，柳春梅，楊明峰，薛飛燕，陳青，馬蘭青，呂鶴書 北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 006 北京農(nóng)學(xué)院　農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (北方) 重點實驗室，北京　006

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虎杖苯亞甲基丙酮合酶PcPKS2的表達純化和晶體生長

馬文瑞1，柳春梅2，楊明峰2，薛飛燕2，陳青2，馬蘭青2，呂鶴書2
1 北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206
2 北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (北方) 重點實驗室，北京102206

馬文瑞, 柳春梅, 楊明峰, 等. 虎杖苯亞甲基丙酮合酶PcPKS2的表達純化和晶體生長. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(2): 250–258.

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摘 要:植物類型Ⅲ聚酮合酶超家族 (PKSs)，又稱查爾酮合酶 (Chalcone synthase，CHS) 超家族，催化合成多種植物次生代謝產(chǎn)物的分子骨架。苯亞甲基丙酮合酶 (Benzalacetone synthase，BAS) 催化4-香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A通過一步脫羧縮合反應(yīng)生成苯亞甲基丙酮，是一系列具有重要生物學(xué)活性苯丁烷類化合物及其衍生物的前體化合物。前期工作從虎杖中分離出苯亞甲基丙酮合酶BAS (PcPKS2) 和1個具有CHS和BAS活性的雙功能酶 (PcPKS1)。兩者與超家族其他成員序列經(jīng)比較，在包括門衛(wèi)氨基酸Phe215和Phe265在內(nèi)的重要氨基酸序列存在一定差異。已有蛋白晶體學(xué)研究結(jié)果表明，PKSs家族不同成員的功能多樣性來自于酶催化位點的非常微小的構(gòu)象變化。為了能夠從結(jié)構(gòu)上比較PcPKS2和PcPKS1雙功能酶活性差異可能產(chǎn)生的機制，以確定其高效BAS活性的分子機理，研究利用了大腸桿菌原核表達系統(tǒng)過量表達了C-端融合有His6標(biāo)簽的重組蛋白，經(jīng)純化得到了高純度蛋白。經(jīng)過對其晶體生長條件進行摸索和優(yōu)化，得到了能用于X-射線衍射的單晶，為其結(jié)構(gòu)解析、催化機理研究、了解虎杖聚酮類化合物生物合成機制和該類酶在基因工程中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:虎杖，苯亞甲基丙酮合酶，晶體生長

Received: May 20, 2015; Accepted: October 27, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31300620, 31370674), Foundation of Beijing Municipal Education Committee (Nos. KM201410020001, KM201310020002), Funding for Promotion of Personnel Training and Reform in Beijing University of Agriculture, 2015 Open project of Zhongguancun Laboratory of Agricultural Biotechnology Products and Seed Industry in Beijing University of Agriculture (No. BNRC&YX201404), Funding Project for Beijing Special Personnel (No. 2013D005021000003), Funding Project for Scientific Research Quality Improvement in Beijing University of Agriculture (No. GJB2013001).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31300620, 31370674)，北京市教委面上項目 (Nos. KM201410020001, KM201310020002)，北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物制品與種業(yè)中關(guān)村開放實驗室2015年度開放課題，北京農(nóng)學(xué)院促進人才培養(yǎng)綜合改革專項計劃 (No. BNRC&YX201404)，北京市優(yōu)秀人才基金項目 (No. 2013D005021000003)，北京農(nóng)學(xué)院質(zhì)量提高經(jīng)費 (No. GJB2013001) 資助。

植物類型Ⅲ聚酮合酶超家族 (PKSs)，又稱查爾酮合酶 (Chalcone synthase, CHS) 超家族，催化合成多種植物次生代謝產(chǎn)物的分子骨架，主要包括酚類、芪類以及類黃酮化合物等[1-2]。其中，眾多化合物具有其抗腫瘤、心血管保護、抗氧化功能。目前，來源于聚酮化合物的藥物每年銷售額已超過100億美元。由于生物合成途徑及機制復(fù)雜多變，從而使該類化合物具有顯著多樣的生物學(xué)活性。

目前，已經(jīng)從苔蘚、蕨類、裸子和被子植物中分離了14種植物類型Ⅲ PKS基因[3]。CHS是家族中第一個被發(fā)現(xiàn)研究較深入的成員，催化來自丙二酰輔酶A (Malonyl-CoA) (延伸底物) 的3個乙酰集團通過連續(xù)的縮合反應(yīng)連接到4-香豆酰輔酶A (p-Coumaroyl-CoA) (起始底物)分子上，之后通過克萊森 (Claisen) 型環(huán)化反應(yīng)生成芳香族聚酮化合物柚皮素查爾酮(Naringenin chalcone)，其為類黃酮化合物生物合成的前體[4-9](圖1)。家族中的另一個成員，苯亞甲基丙酮合酶 (Benzalacetone synthase，BAS)催化4-香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A通過一步脫羧縮合反應(yīng)生成苯亞甲基丙酮[10-13]，苯亞甲基丙酮是一系列具有重要生物學(xué)活性苯丁烷類化合物及其衍生物的前體化合物[14-15]。目前這些苯丁烷類化合物主要包括大黃中的林氏蓮花掌素甙 (Glucoside lindleyin)、生姜中的姜酚(Gingerol) 和姜黃 (Curcumin)，以及覆盆子果實中一種獨特的芳香物質(zhì)覆盆子酮 (Raspberry ketone)。覆盆子酮及其衍生物具有多種生物學(xué)活性，如對流感、心肌收縮力衰弱、糖尿病、減肥具有明顯功效，可作為植物源農(nóng)藥等[16-17]。

蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum (Japanese knotweed, Polygonaceae) 是一種富含聚酮化合物的藥用植物，然而虎杖中聚酮化合物的生物合成機制卻鮮有了解。最近，從虎杖中分離出第一個苯亞甲基丙酮合酶BAS (PcPKS2)[18]和1個具有CHS和BAS活性的雙功能酶 (PcPKS1)[19]。PcPKS1和PcPKS2主要表達部位位于虎杖根莖，該器官是虎杖主要功能次生代謝產(chǎn)物合成的主要部位，提示植物中苯亞甲基丙酮的生物合成可能由BAS和CHS/BAS雙功能酶共同承擔(dān)。

Austin and Noel認為紫花苜蓿Medicago sativa CHS2“門衛(wèi)”Phe215和Phe265可能調(diào)節(jié)類型Ⅲ PKS活性位點與輔酶A (CoA) 結(jié)合通道之間的空間結(jié)構(gòu)[20](圖2)。掌葉大黃Rheum Palmatum BAS一個顯著特點是Phe215 (Ms CHS2順序) 被Leu取代，這個位置上的取代對于該酶的BAS活性是必需的[11]。RpBAS的Phe265 (Ms CHS2順序) 與CHS2相比其側(cè)鏈構(gòu)象更加靠近Leu215并形成疏水相互作用。兩個門衛(wèi)氨基酸Leu215和Phe 265的構(gòu)象變化導(dǎo)致了BAS活性腔的入口擴大為CHS2的兩倍，影響了其底物專一性[22]。在PcPKS2序列中Phe215 和Phe265雙雙缺失，分別被Leu和Cys取代[18]。PcPKS1是一個同時擁有CHS和BAS活性的雙功能酶，且PcPKS1的BAS活性催化效率(Kcat/Km) 比PcPKS2高70倍[19]。有趣的是，在PcPKS1序列中，Phe215和Phe265保守存在，預(yù)示PcPKS1須采用區(qū)別于PcPKS2特異的重要氨基酸序列決定BAS活性。

圖1　CHS和BAS催化反應(yīng)過程Fig. 1 Enzyme reactions of CHS and BAS.

圖2　不同種屬CHS、BAS重要氨基酸序列比較Fig. 2 Sequence alignment of crutial amino acids of CHSs and BASs. The sequences of AmCHS2, RpBAS, PcPKS1, PcPKS2 and RiPKS4 are numbered from Ms CHS2.

蛋白晶體學(xué)研究以及基于結(jié)構(gòu)的突變研究表明，PKSs家族不同成員的功能多樣性來自于酶催化位點的非常微小的構(gòu)象變化[17]。在前期研究中已經(jīng)獲得了PcPKS1的晶體[23]。但是，為了能夠比較PcPKS2和PcPKS1雙功能酶活性差異可能產(chǎn)生的機制，以確定其高效BAS活性的分子機理，需要對PcPKS2以及雙功能酶PcPKS1進行三維結(jié)構(gòu)比較。在本研究中，利用原核表達并純化了PcPKS2，并在此基礎(chǔ)上進行了結(jié)晶條件的摸索，獲得了蛋白晶體，為其結(jié)構(gòu)解析、催化機理研究和該類酶在基因工程中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

pET30a質(zhì)粒，克隆菌株DH5α，表達菌株BL21 (DE3) pLysS為本實驗室保存。質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。PFU DNA聚合酶，T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶購自NEB Biorad公司。分子量Marker、親和Ni樹脂購自鼎國昌盛公司。分子篩層析柱Superdex 200 10/300 GL和純化系統(tǒng)Purifier 10購自GE公司。晶體篩選試劑盒購自Hampton Research公司。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成，上游NdeⅠ酶切位點引物為：CGGCTTCAATTGAGGAG，下游SalⅠ酶切位點引物為：TATAATGAATGATGG GCACGCTG。

1.2PcPKS2在大腸桿菌中的表達

目標(biāo)基因經(jīng)PCR擴增及膠回收后，用NdeⅠ和SalⅠ限制性雙酶切，插入經(jīng)同樣酶切后的原核表達載體 pET30(a) (Novagen) 中，從而使PcPKS2以C-端融合有His6標(biāo)簽的重組形式表達。經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定陽性克隆，經(jīng)過測序公司測序確定插入序列的正確性，pET30-PCPKS2質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3) pLysS，小試檢測可溶性表達。

1.3PcPKS2大量表達純化

從重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) pLysS平板上挑取單菌落接入50 mL含卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；按照1∶100比例將菌液接入1 L LB培養(yǎng)基 (補充卡那霉素至終濃度50 mg/mL，氯霉素終濃度34 mg/mL)，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)。600 nm光吸收 (A600) 至0.6–0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5 mmol/L。在25 ℃和180 r/min條件下誘導(dǎo)6 h，6 000×g離心20 min收集菌體。

1 L重組大腸桿菌培養(yǎng)物用于純化，使用40 mL裂解緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟，8 μg/mL亮抑酶肽，4 μg/mL抑酶肽)。細胞破碎采用超聲方法，使用400 W功率超聲15 s 3次 (JY92-IIDN，寧波新芝)。裂解物經(jīng)高速離心 (10 000×g，12 min)，將離心得到的上清與5 mL Ni-Agarose 結(jié)合2 h，進一步裝柱，與樹脂結(jié)合的PcPKS2在20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、300 mmol/L NaCl、150 mmol/L 咪唑條件下被洗脫。濃縮洗脫下來的目的蛋白至體積約為2.0 mL，加樣至Superdex 200 10/300 GL進行凝膠層析。使用緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT。收集主要目標(biāo)蛋白峰，SDS-PAGE檢測純度。

1.4蛋白晶體生長條件篩選和優(yōu)化

使用10 kDa截留量的超濾濃縮管，將PcPKS2濃縮至20 mg/mL。使用溶液為20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT。結(jié)晶采用懸滴式氣相擴散法。蛋白溶液與沉淀劑溶液1∶1等量混合，置于Linbro 24 孔結(jié)晶板，池液500 μL。初次篩選為Hampton Crystal Screen & II的96個結(jié)晶條件，經(jīng)過22 ℃培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察。單獨的PcPKS2或其與催化產(chǎn)物 (苯亞甲基丙酮，終濃度為1 mmol/L) 復(fù)合物進行蛋白晶體生長條件的嘗試。

1.5X-射線衍射鑒定蛋白晶體

晶體長出后約72 h被快速冷凍，防凍液為30% PEG 8000，5%甘油，利用取樣環(huán)將晶體快速轉(zhuǎn)至數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)的液氮氣流中上樣。X-射線衍射利用了FR-E X-射線光源 (日本理學(xué)公司，Riguka)，收集面探系統(tǒng)為RAXIS4++ (Area Detector Systems Corporation)。收集距離為160 mm，波長為1.5418 ?。數(shù)據(jù)初步分析采用了MOSFLM軟件 (Collaborative Computational Project, Number 4，1994)[24-25]。

2　結(jié)果

2.1pET30a-PCPKS2重組子的鑒定

利用已有PCPKS2基因為模板，PCR擴增得到片段，純化回收后將其連接在pET30a載體上。菌液PCR鑒定的陽性菌落，提取質(zhì)粒后用NdeⅠ和SalⅠ進行酶切鑒定。切出片段符合預(yù)期1 167 bp (圖3)，經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序確認插入正確無突變。

圖3　PCPKS2基因PCR擴增及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig. 3 PCR amplification of PCPKS2 gene and double enzymatic digestion of the recombinant plasmid. (A) PCR amplification of PCPKS2. M: DNA ladder; 1: PCR product of PCPKS2. (B) Double enzymatic digestion of the recombinant plasmid. M: DNA ladder; 2: digested with NdeⅠand SalⅠ.

2.2蛋白表達與純化

利用大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS菌株進行了小量表達以優(yōu)化表達量和可溶性成分的比例。嘗試了利用不同的溫度18 ℃、25 ℃和37 ℃下，不同的誘導(dǎo)劑濃度 (0.2 mmol/L、0.5 mmol/L 和1.0 mmol/L IPTG) 進行誘導(dǎo)，在不同的誘導(dǎo)時間留樣 (2、4、6和16 h)，進行SDS-PAGE電泳分析確定最佳誘導(dǎo)條件。最終確定了最佳表達條件為25 ℃，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，在這樣的條件下，PcPKS2表達量高并大部分呈可溶性。

大腸桿菌經(jīng)裂解后通過5 mL Ni2+金屬螯合柱進行純化，C-端連有His6的PcPKS2與樹脂結(jié)合，并在150 mmol/L咪唑濃度條件下被洗脫。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 分析呈現(xiàn)主要條帶，分子量約為43 kDa，與PcPKS2分子量相符，以及幾條弱的雜蛋白條帶 (圖4)。

樣品進一步進行了分子篩層析純化，出現(xiàn)單一洗脫峰，其洗脫收集液經(jīng)進行電泳分析。與親和層析結(jié)果比較表明Superdex 200凝膠層析對幾種高分子量雜蛋白的除去效果不明顯，但低分子量雜蛋白進一步被去除，使蛋白達到較高的純度 (圖5)。純化后蛋白被濃縮至20 mg/mL用于蛋白結(jié)晶。

圖4　SDS-PAGE檢測PcPKS2親和層析純化結(jié)果 (考馬斯亮藍染色)Fig. 4 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of recombinant PcPKS2 over the affinity chromatography, stained with Coomassie Blue. (A) PcPKS2 solubility analysis after the cell lysis. M: molecular mass standards; 1: whole cell of E. coli BL21(DE3)pLysS; 2: soluble fraction of the lysate; 3: insoluble fraction of the lysate; 4–5: unbound fraction to the column. (B) Purification over the Ni column. M: molecular mass standards; 1–7: eluted fractions.

圖5　PcPKS2分子篩層析純化結(jié)果Fig. 5 Gel filtration chromatography analysis of PcPKS2. (A) SDS-PAGE of Superdex 200 column elutions of PcPKS2. (B) Gel filtration profile of PcPKS2 through Superdex 200.

2.3蛋白晶體生長條件篩選和優(yōu)化

對PcPKS2進行蛋白晶體生長條件的初篩。在初篩約24 h后，在幾個結(jié)晶條件下可以看到出現(xiàn)晶狀沉淀或微晶，其中在Crystal Screen試劑盒的條件15有一些成蔟生長的針狀或片狀結(jié)晶產(chǎn)物 (30% PEG 8 000，100 mmol/L 三水二甲砷酸鈉，Hepes pH 6.5，0.2 mol/L (NH4)2SO4)(圖6)。初篩時的蛋白晶體個體較小，形狀不規(guī)則，很多小晶體混雜生長在一起。利用實驗室自配的聚乙二醇8 000作為沉淀劑溶液進行實驗，同樣獲得了重復(fù)出現(xiàn)的微晶。進一步對該條件進行添加劑條件優(yōu)化，利用添加劑試劑盒(Additive Screen conditions，Hampton Research)進行搜索。其中山梨糖醇明顯改善了晶體生長。最終用于結(jié)晶的沉淀劑溶液為100 mmol/L Tris (pH 8.0)、17% PEG 8 000、10 mmol/L DTT、3% (W/V) 山梨糖醇。最后經(jīng)培養(yǎng)約3 d的片狀單晶體，利用X-射線衍射鑒定證實為蛋白的單晶。

2.4X-射線衍射鑒定蛋白晶體

晶體經(jīng)衍射鑒定為蛋白晶體，分辨率至最少為3.5 ? (圖7)。初步處理顯示空間群為P222，晶胞參數(shù)為a=82.23，b=83.11，c=119.7 ?。實驗中得到的片狀晶體因為較薄，還無法用于衍射數(shù)據(jù)的收集。

圖6　PcPKS2晶體圖片F(xiàn)ig. 6 Photographs of PcPKS2 crystals. (A) Microcrystals grown in 30% PEG 8 000, 100 mmol/L sodium cacodylate trihydrate Na Hepes pH 6.5, 0.2 mol/L (NH4)2SO4. (B) Plate-shaped single PcPKS2 crystals grown with the additive of 3% (W/V) sorbitol.

圖7　PcPKS2蛋白晶體經(jīng)X-射線衍射的圖片F(xiàn)ig. 7 Typical X-ray diffraction pattern of PcPKS2 crystal.

3　討論

虎杖因其富含聚酮化合物是一種被廣為應(yīng)用的藥用植物，然而其體內(nèi)聚酮化合物的生物合成機制卻鮮有報道。PcPKS2是第一個被報道的虎杖中發(fā)現(xiàn)的BAS。我們針對PcPKS2所具有BAS催化活性的機理展開研究。在原核系統(tǒng)中表達的PcPKS2具有良好的可溶性，使我們能夠進行蛋白結(jié)晶的研究。

前期工作中，我們在原核生物中超量表達了PcPKS2的全長蛋白。PcPKS2首先被插入到pET30(a) 表達載體BamHⅠ和SalⅠ位點之間，以具有N-端His6標(biāo)簽序列的形式融合表達，然而在后續(xù)的結(jié)晶實驗中，蛋白晶體出現(xiàn)多晶、鑲嵌生長的現(xiàn)象，質(zhì)量差難以優(yōu)化。在經(jīng)過序列分析后，后期工作重新構(gòu)建表達載體，PCPKS2被插入到NdeⅠ和SalⅠ位點之間，從而去除了融合蛋白中N-末端的約50氨基酸表達載體序列，PcPKS2表達為C-端具有His6標(biāo)簽的融合蛋白。這種改變在后續(xù)的結(jié)晶實驗中被證實有效，因為減少融合蛋白的柔韌性從而增加了PcPKS2蛋白的結(jié)構(gòu)上的均一性，對于蛋白晶體改善是關(guān)鍵的一步。通過嘗試不同的沉淀劑和添加劑，最終得到了蛋白的單晶體。

實驗中得到的片狀單晶體因為較薄，還無法用于衍射數(shù)據(jù)的收集，因此，今后本研究的工作重點將集中在晶體生長條件的優(yōu)化上。通過進一步降低晶體生長速度，使晶體內(nèi)部原子排列更為有序，以及嘗試不同的添加劑的組合等優(yōu)化手段，提高晶體的質(zhì)量。本研究為其結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究以及基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計提供了基礎(chǔ)，從而為該類酶在基因工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

生物育種與工藝優(yōu)化

Preparation and crystallization of Polygonum cuspidatum benzalacetone synthase

Wenrui Ma1, Chunmei Liu2, Mingfeng Yang2, Feiyan Xue2, Qing Chen2, Lanqing Ma2, and Heshu Lü2
1 Plant Science and Technology College, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China
2 Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture China, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China

Abstract:The chalcone synthase (CHS) superfamily of the type III polyketide synthases (PKSs) generates backbones of a variety of plant secondary metabolites. Benzalacetone synthase (BAS) catalyzes a condensation reaction of decarboxylation between the substrates of 4-coumaric coenzyme A and malonyl coenzyme A to generate benzylidene acetone, whose derivatives are series of compounds with various biological activities. A BAS gene Pcpks2 and a bifunctional CHS/BAS PcPKS1 were isolated from medicinal plant P. cuspidatum. Crystallographic and structure-based mutagenesis studies indicate that the functional diversity of the CHS-superfamily enzymes is principally derived from small modifications of the active site architecture. In order to obtain an understanding of the biosynthesis of polyketides in P. cuspidatum, which has been poorly described, as well as of its activation mechanism, PcPKS2 was overexpressed in Escherichia coli as a C-terminally poly-His-tagged fusion protein, purified to homogeneity and crystallized, which is helpful for the clarification of the catalytic mechanism of the enzyme and lays the foundation for its genetic engineering manipulation.

Keywords:Polygonum cuspidatum, benzalacetone synthase, protein crystallization

Corresponding authors: Lanqing Ma. Tel: +86-10-80797305; E-mail: lqma@bac.edu.cn Heshu Lü. Tel: +86-10-80797308; E-mail: lvheshu@163.com