楊四梅,　張佳瑤,　李　菲,　胡旭芳,　曹秋娥

(云南大學化學科學與工程學院, 教育部自然資源藥物化學重點實驗室, 云南 昆明 650091)

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基于離子液體促進的手性配體交換毛細管電泳法分離分析去氧腎上腺素光學異構體

楊四梅,張佳瑤,李菲,胡旭芳,曹秋娥*

(云南大學化學科學與工程學院, 教育部自然資源藥物化學重點實驗室, 云南 昆明 650091)

摘要:基于非手性離子液體對手性配體交換的促進作用,建立了一種測定去氧腎上腺素手性異構體的毛細管電泳分離分析方法。在系統(tǒng)優(yōu)化了電泳條件后,采用20 kV的分離電壓、25 ℃的毛細管柱溫、254 nm的檢測波長以及5 s的壓力(3 447 Pa)進樣時間,在添加4.0 mmol/L Cu(Ⅱ)、8.0 mmol/L L-脯氨酸(L-Pro)和15 mmol/L氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)的20 mmol/L Tris-H3PO4緩沖溶液(pH 5.4)中,R-去氧腎上腺素和S-去氧腎上腺素的分離度為1.42,峰面積與質量濃度分別在12.5～150.0 mg/L和15.0～150.0 mg/L范圍內有線性關系。將該方法用于加標血液和尿液樣品中R和S型去氧腎上腺素的測定,尿液中的加標回收率為93.7%～108.2%,相對標準偏差在3.18%(n=3)以內；血液中的加標回收率為91.4%～113.1%,相對標準偏差在4.82%(n=3)以內。

關鍵詞:毛細管電泳;手性配體交換;離子液體;去氧腎上腺素;光學異構體;手性分離

手性配體交換毛細管電泳始于Gassmann等[1]用Cu(Ⅱ)-L-組氨酸配合物為添加劑分離丹?；被釋τ丑w,其分離識別機理一般認為是分析對象與金屬手性配合物中的部分手性配體發(fā)生了配體交換作用并形成三元配合物,而具有不同構象的異構體分子形成的三元配合物的穩(wěn)定性存在差異,從而得到分離。目前,手性配體交換毛細管電泳已成為分離手性化合物的重要電泳模式之一,并在氨基酸、羥基酸等對映體的分離分析中受到了人們的高度重視[2-7],但用其分離其他類型的藥物對映體的研究報道較少。而且金屬配合物體系容易吸附在毛細管內壁上,導致多數(shù)方法的重現(xiàn)性不夠理想,難以用于定量測定。離子液體一般由有機陽離子和無機陰離子組成,其陽離子部分能在毛細管內壁發(fā)生吸附作用,這不僅可以改變毛細管內壁的電荷情況,改善分離,而且吸附在毛細管內壁上的離子液體與組分分子的相互作用也能對分離產生促進作用。因此,近年來將離子液體作為毛細管電泳的添加劑來改善分離尤其是改善環(huán)糊精對手性藥物的分離得到了廣泛關注[8-13]。

去氧腎上腺素為人工合成擬腎上腺素藥,在臨床上不僅常用于治療感染中毒性及過敏性休克心搏驟停、支氣管哮喘等,還可用于治療感冒的復方制劑中,以緩解感冒引起的發(fā)熱、頭痛、鼻塞、全身酸痛等癥狀。去氧腎上腺素具有左旋(R構型)和右旋(S構型)兩種光學異構體,其中R構型為光學活性體,S構型為無效異構體。因此控制產品中S構型的含量對于該藥物的療效至關重要。目前報道的分離分析去氧腎上腺素光學異構體的方法主要是手性色譜法[14],基本未見毛細管電泳法。本文采用手性配體交換毛細管電泳法,以離子液體為添加劑,對去氧腎上腺素手性對映體進行了分離分析。結果表明,將氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)添加到含有Cu(Ⅱ)與L-脯氨酸手性配合物的電解質溶液中后,原本重疊嚴重的去氧腎上腺素手性對映體的電泳峰實現(xiàn)了有效分離,這不僅證明了[BMIM]Cl對Cu(Ⅱ)與L-脯氨酸手性配合物體系電泳分離去氧腎上腺素手性對映體有促進作用,而且據(jù)此現(xiàn)象建立的分離分析去氧腎上腺素光學異構體的毛細管電泳法與文獻報道的色譜法[14]相比,具有簡單、快速,能準確定量的優(yōu)點。

1實驗部分

1.1主要儀器與試劑

P/ACETMMDQ型高效毛細管電泳儀帶二極管陣列紫外檢測器(美國Beckman Coulter公司),數(shù)據(jù)處理采用32Karat軟件;未涂層石英毛細管(57 cm×75 μm,有效長度50 cm;河北省永年銳灃色譜器件有限公司)。

標準品R-去氧腎上腺素和去氧腎上腺素外消旋體鹽酸鹽購于美國Sigma公司;L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-組氨酸(L-His)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-色氨酸(L-Trp)、L-賴氨酸(L-Lys)、L-亮氨酸(L-Leu)購自上海華美生物工程公司;[BMIM]Cl購于上海邁瑞爾化學技術有限公司。

實驗用試劑除特別說明外均為分析純,水為高純水。

1.2溶液配制

標準溶液:R-去氧腎上腺素和去氧腎上腺素外消旋體標準儲備溶液均用水配制,4 ℃下保存;工作溶液由儲備溶液用水稀釋得到。

樣品溶液:將取自健康人的尿樣與血樣(云南大學校醫(yī)院)以及加標后的尿樣與血樣在2 000 r/min下離心10 min,上清液用0.45 μm濾膜過濾后直接進樣分析。

1.3HPCE的條件與方法

運行電解質溶液為含有4.0 mmol/L Cu(Ⅱ)、8.0 mmol/L L-Pro、15.0 mmol/L [BMIM]Cl的20 mmol/L Tris-H3PO4緩沖溶液(pH 5.4),使用前用0.45 μm濾膜過濾;分離電壓為20 kV,柱溫為25 ℃,檢測波長為254 nm,采用壓力(3 447 Pa)進樣5.0 s。為了確保重現(xiàn)性,毛細管柱每天在運行前和兩次運行間依次用0.1 mmol/L NaOH溶液、水和運行電解質溶液各沖洗5 min。

2結果與討論

基于去氧腎上腺素分子中的相鄰位置上含有一個-OH基及一個N原子,具有與Cu(Ⅱ)配位的能力,而且其中的-OH基還處于手性C原子上,其與Cu(Ⅱ)配位的能力隨光學結構的不同會有所不同,因此擬采用手性配體交換原理實現(xiàn)去氧腎上腺素外消旋體的分離。為此,實驗首先在無其他添加劑的情況下,研究了以手性配體交換毛細管電泳中常用的幾種氨基酸(L-Phe、L-His、L-Pro、L-Trp、L-Lys以及L-Leu)與Cu(Ⅱ)的配合物為手性選擇劑,對去氧腎上腺素外消旋體進行分離。結果表明,在上述手性配合物存在下,雖經多方案優(yōu)化電泳條件,去氧腎上腺素外消旋體都沒有得到基本分離?？紤]到離子液體在電泳中對分離尤其對環(huán)糊精分離手性藥物的改善作用,實驗嘗試了在手性配體交換基礎上,引入離子液體作為添加劑,利用離子液體對手性配體交換的促進作用,達到對去氧腎上腺素外消旋體分離的目的。

2.1配體種類、配合物組成比例及濃度的影響

選擇了簡單易得且溶解性好的咪唑類離子液體[BMIM]Cl為添加劑,在含有10 mmol/L [BMIM]Cl的20 mmol/L Tris-H3PO4緩沖溶液(pH 5.0)中添加3.0 mmol/L的Cu(Ⅱ)以及6.0 mmol/L氨基酸(L-Pro、L-Trp、L-Phe、L-His、L-Lys及L-Leu),研究了不同的手性配體對分離與檢測的影響。結果表明,添加L-Lys和L-Leu與Cu(Ⅱ)的配合物對去氧腎上腺素外消旋體的分離基本沒有作用,但添加其余4種手性氨基酸與Cu(Ⅱ)的配合物可以使去氧腎上腺素外消旋體得到一定程度的分離,其中以加入L-Pro與Cu(Ⅱ)的配合物得到的分離度最大,為1.02。因此,實驗選擇L-Pro與Cu(Ⅱ)的配合物作為分離去氧腎上腺素外消旋體的手性選擇劑,并進一步研究了L-Pro與Cu(Ⅱ)的加入比例以及濃度對分離的影響。

固定電解質溶液中Cu(Ⅱ)的濃度為3.0 mmol/L,依次加入不同濃度的L-Pro,組成L-Pro與Cu(Ⅱ)的物質的量比依次為0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1及4∶1的配合物體系,考察了L-Pro與Cu(Ⅱ)的比例對去氧腎上腺素外消旋體分離的影響。圖1a的結果表明,去氧腎上腺素外消旋體的分離度隨L-Pro與Cu(Ⅱ)加入比例的增加先增大后減小,當加入的物質的量比為2∶1時,具有最大的分離度。

保持L-Pro與Cu(Ⅱ)的物質的量比為2∶1不變,在1.0～6.0 mol/L配合物濃度范圍內,研究了配合物Cu(L-Pro)2的濃度對分離的影響。隨著配合物濃度的增加,去氧腎上腺素外消旋體的分離度有所提高(見圖1b),但組分的遷移時間有所延長,基線噪聲增加,檢測靈敏度下降。這是因為隨著配合物濃度的增加,電解質溶液的離子強度以及背景吸收都會增加。綜合考慮分離度、分析時間、檢測靈敏度以及基線噪聲,選擇4.0 mmol/LCu(L-Pro)2為分離去氧腎上腺素外消旋體的手性選擇劑。

圖1　(a)L-脯氨酸(L-Pro)與Cu(Ⅱ)的物質的量比及 (b)Cu(L-Pro)2的濃度對去氧腎上腺素光學異構體分離度的影響Fig. 1　Effects of (a) the mole ratio of L-proline (L-Pro) to Cu(Ⅱ) and (b) concentration of Cu(L-Pro)2 on the resolution for the separation of the optical isomers of phenylephrine

2.2電解質溶液的pH以及緩沖溶液濃度的影響

在固定電解質溶液中Cu(L-Pro)2的濃度為4.0 mmol/L以及Tris濃度為20 mmol/L條件下,用H3PO4溶液在pH 3.5～8.0范圍內調節(jié)電解質溶液的pH,試驗了pH值對分離的影響。結果表明,隨著電解質溶液pH的增加,去氧腎上腺素兩個光學異構體的遷移時間均先縮短后增長,分離度則先增加后降低(見圖2)。當pH為5.4時,去氧腎上腺素異構體的分離度具有最大值,而且遷移時間較短。這可能是因為隨著電解質溶液pH的增加,一方面毛細管內壁帶負電荷的程度增加,電滲流增加;另一方面去氧腎上腺素的酚羥基的電離能力也隨之增強,遷移速度下降,因此去氧腎上腺素異構體的遷移時間隨溶液pH的變化有最小值。此外,在電解質溶液的pH較低時,Cu(Ⅱ)與L-Pro之間難以形成穩(wěn)定的配合物,因此對去氧腎上腺素異構體的分離能力較差;而當pH較高時,Cu(Ⅱ)與L-Pro形成的配合物可能過于穩(wěn)定,從而難以被去氧腎上腺素異構體置換,因此分離度也不高。實驗最終選擇電解質溶液的pH值為5.4。

緩沖溶液的濃度對分離有一定的影響。在10～50 mmol/L范圍內,隨著緩沖溶液濃度的增加,組分的分離度變化不明顯,但遷移時間和基線噪聲特別是基線噪聲有所增加。因此,實驗選用20 mmol/L Tris-H3PO4(pH 5.4)為分離緩沖體系。

圖2　電解質溶液的pH值對R-去氧腎上腺素和S-去氧腎上腺素遷移時間的影響Fig. 2　Effect of the pH value of electrolyte solution on the migration times of R-phenylephrine and S-phenylephrine

2.3[BMIM]Cl濃度的影響

圖3是電解質溶液中離子液體[BMIM]Cl的濃度對去氧腎上腺素異構體遷移時間的影響?？梢?在沒有[BMIM]Cl存在時,兩組分重疊嚴重,基本上沒有得到分離。隨著[BMIM]Cl的濃度在5～20 mmol/L范圍內不斷增加,兩組分的遷移時間和分離度均增加。但當離子液體的濃度超過15 mmol/L以后,基線噪聲明顯增大,而且峰形有所展寬。這可能是因為隨著[BMIM]Cl濃度的增加,不僅電解質溶液的離子強度增加,而且離子液體帶正電荷的部分在毛細管內壁上的吸附量增加,因此電滲流降低,組分遷移時間延長,基線噪聲增大。同時,隨著離子液體濃度的增加,其與被分離物之間的相互作用增加,因此分離度增加。綜合考慮,選擇[BMIM]Cl的濃度為15 mmol/L。

圖3　氯化-1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)濃度對R-去氧腎上腺素和S-去氧腎上腺素遷移時間的影響Fig. 3　Effect of the concentration of 1-butyl-3- methylimidazolium chloride ([BMIM]Cl) on the migration times of R-phenylephrine and S-phenylephrine

2.4電壓、柱溫和進樣時間的影響

在上述選定的電解質溶液中,研究了分離電壓、柱溫和進樣時間對去氧腎上腺素光學異構體分離的影響。結果表明,隨著分離電壓和毛細管柱溫的增加,去氧腎上腺素兩個光學異構體的遷移時間均不斷縮短,分離度下降,而且當電壓達到25 kV(柱溫為25 ℃)或柱溫達到30 ℃(電壓為20 kV)以上時,基線噪聲明顯,容易出現(xiàn)斷流現(xiàn)象。組分的檢測靈敏度隨著進樣時間(進樣壓力為3 447 Pa)的增加而增大,但組分的峰形在進樣時間大于5 s后逐漸展寬,分離度下降。實驗選用了分離電壓為20 kV,毛細管柱溫為25 ℃,在3 447 Pa壓力下進樣5.0 s。

圖4為在上述選定的電泳條件下得到的去氧腎上腺素外消旋體及加標血清樣品的代表性電泳圖?？梢?在此條件下,去氧腎上腺素的兩個光學異構體不管是在標準溶液還是血清樣品中都得到了有效分離。

圖4　(a)空白血樣、(b)加標血樣以及(c)去氧腎上腺素外消旋體標準溶液的電泳圖Fig. 4　Electropherograms of (a) a blank blood sample, (b) the blood spiked with phenylephrine raceme and (c) the standard solution of phenylephrine raceme　Separation conditions: running buffer, 20 mmol/L Tris-H3PO4 buffer (pH 5.4) composed of 4.0 mmol/L Cu(Ⅱ), 8.0 mmol/L L-Pro and 15 mmol/L [BMIM]Cl; applied voltage, 20 kV; capillary temperature, 25 ℃; detection wavelength, 254 nm; injection, 5 s at 3 447 Pa.　Peaks: 1. R-phenylephrine; 2. S-phenylephrine.

2.5工作曲線和方法的精密度

在優(yōu)化后的實驗條件下,首先對一系列不同濃度的R-去氧腎上腺素標準溶液進行電泳分析,得到了R-去氧腎上腺素的工作曲線,然后用該工作曲線求得去氧腎上腺素外消旋體標準溶液中R-去氧腎上腺素的濃度,再用總濃度差減后求得外消旋體標準溶液中S-去氧腎上腺素的濃度,并由此得到了S-去氧腎上腺素的工作曲線。同時,實驗還對100 mg/L的外消旋體標準溶液進行了5次平行測定,得到了兩個光學異構體的峰面積A與遷移時間t的相對標準偏差(RSD)。表1的結果表明,方法具有較好的重現(xiàn)性和一定的實際應用價值。

表 1　方法的線性關系與精密度

A: peak area;C: mass concentration, mg/L.

2.6樣品的測定結果及加標回收率

將處理后的空白及加標血液與尿液樣品,用優(yōu)化后的電泳條件進行了分離分析,結果見表2?？梢?在空白血液與尿液中均沒有檢測到R-去氧腎上腺素與S-去氧腎上腺素,而R-去氧腎上腺素與S-去氧腎上腺素在尿液中的加標回收率為93.7%～108.2%,相對標準偏差在3.18%(n=3)以內,在血液中的加標回收率為91.4%～113.1%,相對標準偏差在4.82%(n=3)以內。

表 2　樣品測定結果及加標回收率(n=3)

3結論

研究結果表明,離子液體氯化-1-丁基-3-甲基咪唑對Cu(Ⅱ)與L-脯氨酸手性配合物體系電泳分離去氧腎上腺素光學異構體具有促進作用。而且基于配體交換與離子液體協(xié)同作用建立的分離分析去氧腎上腺素光學異構體的毛細管電泳方法具有較好的分離度與較高的定量分析準確度,有一定的實際應用價值。

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Separation and determination of optical isomers of phenylephrine by chiral ligand exchange capillary electrophoresis coupling with the promoting effect of ionic liquid

YANG Simei, ZHANG Jiayao, LI Fei, HU Xufang, CAO Qiue*

(Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Nature Resource, Ministry of Education, School of Chemical Science and Technology, Yunnan University, Kunming 650091, China)

Abstract:A method for the separation and determination of optical isomers of phenylephrine was developed based on the promoting effect of non-chiral ionic liquid on chiral ligand-exchange capillary electrophoresis after the electrophoretic parameters were optimized systematically. R-phenylephrine and S-phenylephrine can be separated and determined effectively in 20 mmol/L Tris-H3PO4 buffer solution (pH 5.4) composed of 4.0 mmol/L Cu(Ⅱ), 8.0 mmol/L L-proline (L-Pro) and 15 mmol/L 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([BMIM]Cl) with the applied voltage of 20 kV, capillary temperature of 25 ℃, detection wavelength of 254 nm, and injection of 5 s at 3 447 Pa. The resolution of R- and S-phenylephrines was 1.42. The linear ranges for the determination of R-phenylephrine and S-phenylephrine were 12.5-150 mg/L and 15.0-150 mg/L, respectively. The method has been satisfactorily used for the determination of R-phenylephrine and S-phenylephrine in the spiked blood and urine samples. The spiked recoveries in the urine sample were in the range of 93.7%-108.2% with the RSDs lower than 3.18%(n=3), and the spiked recoveries in the blood sample were in the range of 91.4% and 113.1% with the RSDs lower than 4.82%(n=3).

Key words:capillary electrophoresis; chiral ligand exchange; ionic liquid; phenylephrine; optical isomers; chiral separation

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.10013

*收稿日期:2015-10-12

基金項目:國家自然科學基金項目(21465025).

中圖分類號:O658

文獻標識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)01-0103-05

色譜手性分離?？ぱ芯空撐?/p>

*通訊聯(lián)系人.Tel:(0871)65033718,E-mail:qecao@ynu.edu.cn.

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21465025).