郭會燦

（石家莊職業(yè)技術學院 化學工程系，石家莊 050081）

重組天花粉蛋白與YH-16聯(lián)合用藥抑制黑色素瘤細胞增殖及成瘤

郭會燦

（石家莊職業(yè)技術學院 化學工程系，石家莊 050081）

獲得人源天花粉蛋白并研究其與YH-16聯(lián)合用藥對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10增殖及成瘤的作用。以大腸桿菌BL21重組表達天花粉蛋白rTCS并以親和層析法純化rTCS；以MTT法檢測rTCS、YH-16、rTCS+YH-16對B16-F10細胞生長的影響；體內(nèi)實驗檢測rTCS、rTCS+YH-16對瘤體生長的作用。結(jié)果表明，獲得了電泳純重組天花粉蛋白rTCS；rTCS可顯著抑制B16-F10細胞增殖，并且抑制率顯著高于YH-16組，但是rTCS與YH-16聯(lián)合處理組并未比rTCS組有顯著差異；rTCS與YH-16聯(lián)合用藥明顯抑制B16-F10細胞在小鼠體內(nèi)成瘤。重組天花粉蛋白rTCS聯(lián)合YH-16用藥對黑色素瘤細胞B16-F10的增殖及成瘤有顯著抑制作用。聯(lián)合策略將為治療黑色素瘤患者提供新的契機。

天花粉蛋白；YH-16；B16-F10；腫瘤；聯(lián)合治療

黑色素瘤是一類高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命安全。弱免疫原性及豐富的腫瘤外周血管生成是黑色素瘤的兩大特征，也是實體腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視及獲取充足營養(yǎng)的兩條重要途徑［1］。因而設計新治療策略同時增強對黑色素瘤的免疫殺傷效應及阻斷腫瘤外周血管生成對治療黑色素瘤有重要臨床意義。

天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）是一種提取自栝樓塊根中的堿性單鏈核糖體失活蛋白（Ribosome inactivating protein，RIP），其N-糖苷酶活性，能水解斷裂真核細胞核糖體28S rRNA 腺苷酸的N-C 糖苷鍵，不可逆失活核糖體，從而抑制蛋白質(zhì)的合成［2］。大量研究數(shù)據(jù)表明天花粉蛋白具有正向免疫調(diào)節(jié)作用，能促進多種腫瘤細胞凋亡［3-6］。YH-16，又名恩度，是一類來源于血管基底膜膠原的大分子膜蛋白，由基質(zhì)金屬蛋白酶水解釋放得到，已被成功開發(fā)并應用于非小細胞肺癌的治療，其作用機制是抑制腫瘤的血管生成，切斷腫瘤細胞能量及營養(yǎng)供應，從而達到治療腫瘤的效果［7，8］。

據(jù)此，本研究借助基因工程方法重組表達天花粉蛋白并分析其對黑色素瘤細胞的增殖及體內(nèi)成瘤的影響，同時考察天花粉蛋白與YH-16聯(lián)合用藥對黑色素瘤的治療效果，以期為開發(fā)黑色素瘤治療提供新的契機。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株、實驗動物 黑色素瘤細胞B16購自中科院上海細胞所；C57BL/6小鼠，雌性，6-8周齡購自南京醫(yī)科大學動物中心。

1.1.2 主要試劑 蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、誘導劑IPTG與雙抗（100 μg/mL的鏈霉素、100 U/mL的青霉素）購自上海生工生物工程公司；YH-16購自煙臺麥得津生物公司；抗TCS抗體購自Santa Cruz公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Invitrogen公司；MTT（methylthiazolyl tetrazolium）購自美國Fluka公司；胰RNase購自美國Sigma公司；DH5α及BL21細胞購自南京天根生物有限公司；Taq酶購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 表達載體pET22b-rTCS的構(gòu)建 設計引物PF、PR，在其兩端分別添加Nde I及Nhe I酶切位點，以本實驗室保存的質(zhì)粒pbs-rTCS為模板，PCR擴增rTCS基因片段并進行T-A克隆。經(jīng)酶切鑒定及DNA測序得到正確質(zhì)粒pMD18T-rTCS；然后用Nde Ι及Nhe Ι酶同時處理質(zhì)粒pMD18T-rTCS與pET-22b，膠回收目的片段，并經(jīng)T4 ligase連接過夜。轉(zhuǎn)化BL21細胞，篩選陽性菌株。

1.2.2 重組rTCS的表達、純化及Western blot鑒定 隨機挑選幾個單克隆，分別以2 mL LB培養(yǎng)基37℃，250 r/min震蕩培養(yǎng)過夜，然后按照1%轉(zhuǎn)接至50 mL LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至吸光度OD600達到0.6-0.8時加入誘導劑IPTG至終濃度0.42 mmol/L，繼續(xù)誘導5 h取樣1 mL離心、收集菌體。加入70 μL水及15 μL 5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，離心2 min，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達。

以鎳柱純化重組天花粉蛋白rTCS，具體如下：取3 mL鎳柱填料裝柱，以5倍柱體積去離子水沖洗，以5倍柱體積磷酸鹽緩沖液平衡，進樣，收集穿透液。再以10 mL含50、100和200 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液依次線性過柱并收集洗脫液。最后以5倍柱體積去離子水洗脫柱并保存在20%乙醇溶液中，于4℃放置。

以抗天花粉蛋白抗體鑒定重組表達的rTCS。對rTCS進行SDS-PAGE電泳分析并剪下含rTCS的膠條，轉(zhuǎn)膜250 mA恒流轉(zhuǎn)30 min；電轉(zhuǎn)完成后取下PVDF膜并作好標記置于含5%的脫脂奶粉（TBS配制）中封閉，37℃，1 h低速震蕩。加入一抗（用封閉液稀釋），4℃搖床孵育過夜。棄一抗溶液，用TBST洗滌5 min左右，3次。加入二抗（用TBS稀釋），室溫下于搖床孵育1 h。棄二抗溶液，用TBST洗滌5 min左右，3次。以ECL法檢測特異結(jié)合的抗體，對照Marker記錄實驗結(jié)果，將X膠片晾干掃描保存。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期B16-F10細胞接種于96孔板中，接種密度為每孔100 μL含1×104個細胞，每組設置3個復孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后分別加入不同濃度的重組rTCS繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對照組加等體積PBS。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL濃度為5 mg/mL的 MTT，37℃繼續(xù)溫育4 h。吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO，室溫震蕩溶解結(jié)晶10 min。于570 nm（吸收波長）和630 nm（參比波長）處測吸光光度值。計算細胞存活率，公式如下：

1.2.4 小鼠荷瘤及給藥 調(diào)整B16-F10細胞密度為1×107/mL，經(jīng)小鼠腹部皮下注射0.1 mL細胞懸液，從第6天開始，小鼠隨機分為3組（6只每組）給藥：rTCS組（5 mg/kg/day，i.p.）、rTCS（5 mg/kg/day，i.p.）+YH-16組（1 mg/kg/day，i.p.）及等量PBS對照組，隔天給藥7次，至第18天處死小鼠剝瘤，測量瘤體積V=ab2/2（a為長度，b為寬度）。

1.2.5 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用spss16.0處理，數(shù)據(jù)差異采用t檢驗，顯著性差異P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET22b-rTCS

經(jīng)過PCR擴增、兩步酶切、連接及驗證，天花粉蛋白基因編碼區(qū)（CDS區(qū)）被成功插入表達載體pET-22b（圖1-A），DNA測序進一步證明該克隆的rTCS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中報道序列完全一致。

2.2 重組rTCS的表達、純化及免疫鑒定

如圖1-B，重組天花粉蛋白rTCS在BL21工程菌中經(jīng)過0.42 mmol/L IPTG誘導5 h后得到高效表達，表達量達到200 mg/L，而且rTCS是可溶性表達。與NCBI數(shù)據(jù)庫中報道一致，rTCS分子量在30 kD左右，其電泳條帶位于25-35 kD之間。

經(jīng)0-200 mmol/L咪唑線性濃度洗脫，在120 mmol/L咪唑濃度處rTCS被成功洗脫，純度達到電泳純（圖1-C）。進一步免疫印跡實驗（圖1-D）表明純化的蛋白即是rTCS。

2.3 重組rTCS抑制黑色素瘤細胞B16-F10增殖

研究報道天花粉蛋白能抑制肺癌細胞及乳腺癌細胞MCF-7的增殖、促進HeLa、HL-60細胞的凋亡［3-6，9，10］。如圖2-A，與對照PBS組相比，rTCS對黑色素瘤細胞B16-F10的生長有顯著抑制作用。在120 μg/mL時，rTCS對B16-F10細胞的生長抑制率達到約60%，在480 μg/mL時，其抑制率為95.3%。因此，rTCS對B16-F10細胞的抑制效應呈現(xiàn)劑量依賴性。

YH-16已經(jīng)被用于治療小細胞肺癌患者。我們的體外實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)120 μg/mL rTCS對B16-F10細胞的抑制率顯著高于5 μg/mL YH-16單獨處理組（54.7% vs 33.7%）， 但 是120 μg/mL rTCS聯(lián) 合5 μg/mL YH-16處理組對B16-F10細胞的抑制率約60.4%，與rTCS單獨處理組無顯著性差異（圖2-B）。

圖1 rTCS的表達、純化及鑒定

2.4 重組TCS聯(lián)合YH-16對荷B16-F10瘤體生長的作用

黑色素瘤細胞B16-F10移植瘤小鼠實驗（圖3）顯示，相對于PBS對照組，rTCS處理組及rTCS+YH-16聯(lián)合處理組的腫瘤生長明顯被阻滯。從接種第6天開始給藥，第12天時，rTCS處理組及rTCS+YH-16聯(lián)合處理組的腫瘤體積顯著小于對照組，并且聯(lián)合處理組比rTCS組瘤體積也明顯減小。第18天時，處死小鼠后對瘤體稱重發(fā)現(xiàn)，rTCS單獨處理組瘤體僅15 mg左右，而聯(lián)合處理組基本無肉眼可見瘤體。

在給藥第12天開始，rTCS單獨處理組及與YH-16聯(lián)合用藥組顯著抑制B16-F10細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤。而且聯(lián)合處理組在第18天時基本無可觸及的瘤體。

圖2 rTCS與YH-16對黑色素瘤細胞B16-F10的抑制效應

圖3 rTCS抑制B16-F10細胞裸鼠體內(nèi)成瘤

3 討論

黑色素瘤是一類轉(zhuǎn)移性極高的惡性腫瘤，盡管歷經(jīng)幾十年的治療，人類對該病的治療手段主要還是手術、放化療。而這些傳統(tǒng)方法雖然有一定療效，但是其給患者帶來痛苦的副作用。進入新世紀，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤是一類高異質(zhì)性疾病，多種因素都能引發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。其中腫瘤的免疫原性降低與大量的血管供應對促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。因此研究人員開發(fā)了一系列增強腫瘤患者免疫能力以及減少血管生成的藥物，如白介素IL-2、GM-CSF、TCS、YH-16等［4，7，11，12］。

針對腫瘤的多方面誘導因素，研究人員開展了聯(lián)合治療研究，該策略可以靶向腫瘤的多個靶點，從而達到更強效、更徹底治療腫瘤的目的。研究數(shù)據(jù)也證實化療與免疫治療、兩種免疫治療、抗血管生成治療與免疫治療的聯(lián)合策略顯示了單一療法沒有的優(yōu)勢［12-14］。

本研究中的天花粉蛋白rTCS具有正向免疫調(diào)控的作用，對多種腫瘤細胞都顯示了較強的抑制生長作用，而且天花粉蛋白能誘導多種腫瘤細胞的凋亡［6］。而YH-16已成功上市，其機理就是抑制腫瘤的血管生成［7］。因此本研究采用聯(lián)合治療策略，同時給藥rTCS與YH-16，希望能促進腫瘤免疫殺傷與抑制血管生成。實驗結(jié)果證實相對單一的治療，聯(lián)合用藥組顯示更強的抑制腫瘤生長的作用，并且能降低用藥劑量，即降低rTCS劑量，這將有助于降低rTCS導致的毒性副作用。研究表明YH-16作用機制是阻斷血管生成，切斷腫瘤生長的營養(yǎng)供應，抑制腫瘤生長。因此在本研究中rTCS與YH-16聯(lián)合處理組在細胞水平并沒有顯著的協(xié)同效應也是合理的。而體內(nèi)實驗表明YH-16與rTCS之間對腫瘤抑制具有協(xié)同效應。

然而，目前的數(shù)據(jù)僅表明聯(lián)合用藥對腫瘤生長的抑制作用，尚需要更多研究進行微血管密度的測定、免疫細胞類型的分析，從而為解釋聯(lián)合用藥的機制提供信息以及為腫瘤治療性研究提供更好的理論指導。

4 結(jié)論

本研究以基因重組技術獲得了電泳純的天花粉蛋白，通過體外及體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)其對黑色素瘤細胞B16-F10的增殖及小鼠體內(nèi)成瘤均有很強的抑制作用，而且天花粉蛋白可以協(xié)同YH-16抑制黑色素瘤細胞增殖。

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（責任編輯 馬鑫）

The Inhibition Effect of Recombinant Trichosanthin Combined with YH-16 on the Proliferation and Xenograft Tumor Growth of Melanoma

GUO Hui-can
（Department of Chemistry，Shijiazhuang Vocational Technology Institute，Shijiazhuang 050081）

The objectives of this study are to acquire trichosanthin（rTCS）and to explore the effect of rTCS combined with YH-16 on the proliferation of melanoma B16-F10 and xenograft tumor growth in mice model. rTCS was expressed in Escherichia coli BL21 strain and purified by Ni affinity chromatography. Then the effects of rTCS，YH-16，and combination of rTCS with YH-16 on the cell growth were determined by MTT assay and in vivo trial. Results were as：pure recombinant rTCS protein was obtained. The proliferation of B16-F10 was inhibited significantly by rTCS，and inhibition rate was significantly higher than by YH-16 alone，however，no significant difference between rTCS alone and the combination of rTCS and YH-16. The xenograft tumor growth in the group treated with the combination of rTCS and YH-16 was significantly smaller than the ones by rTCS-treated alone or control. In conclusion，the combination of rTCS with YH-16 presented significant inhibitory effect on proliferation of B16-F10 as well as on xenograft tumor growth，and this strategy with the combination would provide new opportunity for treating melanoma patients.

trichosanthin；YH-16；B16-F10；tumor；combination therapy

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.035

2015-06-19

郭會燦，女，碩士，副教授，研究方向：生物制藥；E-mail：heweibingkkk@126.com