李泰明許麒麟潘俊杰劉曉玫張春

（1. 中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009；2. 中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215163）

AAV-ITR基因表達(dá)微載體在小鼠體內(nèi)表達(dá)

李泰明1許麒麟1潘俊杰2劉曉玫2張春2

（1. 中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009；2. 中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215163）

旨在比較AAV-ITR基因表達(dá)微載體及其單體在小鼠不同部位的表達(dá)差異，將相同拷貝數(shù)的AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP分別轉(zhuǎn)入小鼠腦組織，另外將相同拷貝數(shù)的AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體，AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP轉(zhuǎn)入小鼠骨骼肌中，比較不同時(shí)期組織中的殘余分子數(shù)量。熒光定量PCR、顯微熒光觀察以及熒光平均光密度和熒光灰度值分析表明，相同拷貝數(shù)的AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體比AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP具有更高的轉(zhuǎn)染效率，其穩(wěn)定性也優(yōu)于AAV-ITR基因表達(dá)微載體。結(jié)果顯示，AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體在動(dòng)物體內(nèi)具有高效表達(dá)安全穩(wěn)定的特點(diǎn)，有望成為基因治療中一種安全可靠，穩(wěn)定高效的新型載體。

基因治療；基因表達(dá)微載體；腺相關(guān)病毒（AAV）；RT-PCR；組織切片

基因治療是人類治療腫瘤、傳染病、遺傳病的新方向?；蛑委熞揽哭D(zhuǎn)染性高、安全有效的基因載體，尋找安全有效的基因治療載體是當(dāng)今基因治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。應(yīng)用于基因治療的載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體在基因治療方面雖然有著較高的轉(zhuǎn)染效率和很強(qiáng)的靶向性，但是其作為攜帶外源目的基因的載體在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，不可避免的存在致癌、致毒等風(fēng)險(xiǎn)。這些缺點(diǎn)使得病毒載體在基因治療領(lǐng)域受到了一定的限制［1-3］。在非病毒載體中，質(zhì)粒載體在基因治療中一直占據(jù)重要地位，但是傳統(tǒng)質(zhì)粒有著不可避免的缺點(diǎn)，包括：基因沉默化，未甲基化的序列抑制基因的表達(dá)［4］；含有抗性基因序列等細(xì)菌序列［5］；基因片段大等。而基因表達(dá)微載體能夠有效的避免質(zhì)?；虮磉_(dá)載體的外源基因沉默化，能夠穩(wěn)定存在于機(jī)體組織中。

基因表達(dá)微載體是指不含有細(xì)菌復(fù)制子序列，抗菌素抗性基因序列等細(xì)菌DNA序列，而只有基因表達(dá)所需要的基本元件，如基因表達(dá)啟動(dòng)子、目的基因和加尾系列（poly A），其外源基因能有效表達(dá)的環(huán)狀的DNA分子［6，7］?；虮磉_(dá)微載體不含或很少含細(xì)菌、病毒DNA序列，大大減少了非宿主細(xì)胞的DNA，特別是細(xì)菌DNA的CpG序列、抗菌素抗性基因等，從而可以減少基因治療過程中所引起的機(jī)體免疫反應(yīng)、細(xì)胞炎癥、細(xì)胞毒性等不良副作用［8］?；虮磉_(dá)微載體的分子數(shù)量越小，細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率以及基因表達(dá)效率就越高［9］。目前，針對(duì)pDNA的改造有制備成微環(huán)DNA（mini-circle DNA）和線性共價(jià)閉合微環(huán)DNA（mini-linear covalently closed，minilcc）［10-12］。二者都是盡可能的刪除潛在可能會(huì)引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)以及干擾載體整合效率的序列。研發(fā)一種能安全、長(zhǎng)期、高效、穩(wěn)定表達(dá)外源基因的新型基因表達(dá)載體，將大大促進(jìn)基因治療在人類中應(yīng)用的進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)通過昆蟲細(xì)胞Sf9制備得到的AAV-ITR微載體是一種基于腺相關(guān)病毒倒置末端重復(fù)序列（Inverted terminal repeats，ITR）的單鏈基因表達(dá)微載體，僅含有AAV基因組的兩端的ITR序列和中間的基因表達(dá)框序列。在Sf9中制備得到的微載體無質(zhì)粒中CpG序列、抗菌素的抗性基因序列，因此可以減少傳統(tǒng)質(zhì)粒載體在基因治療過程中的各種不良副作用以及抗生素基因產(chǎn)生的抗藥性，并且能夠安全穩(wěn)定，長(zhǎng)期高效的表達(dá)外源基因。然而，微載體在生產(chǎn)過程中不僅產(chǎn)生單體，還極易形成二聚體和多聚體等多種形式。通過構(gòu)建產(chǎn)生的pUC57-minivector-EGFP質(zhì)粒包含pUC57質(zhì)粒和AAV-ITR微載體序列。因此，本實(shí)驗(yàn)以pUC57-minivector-EGFP質(zhì)粒為對(duì)照研究微載體的單體和多種形式混合體在小鼠組織中的表達(dá)效率和穩(wěn)定性，以期為今后該微載體攜帶治療基因在體內(nèi)的表達(dá)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

AAV-ITR基因表達(dá)微載體，pUC57-minivector-EGFP質(zhì)粒由中科院蘇州醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所檢驗(yàn)室構(gòu)建保存。Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司。Cole氏蘇木素染色液（常規(guī)染色）、加拿大樹膠購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。水合氯醛、多聚甲醛、無水葡萄糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純以上。瓊脂糖粉購(gòu)自Biowest公司。氯化鈉注射液購(gòu)自湖北天藥藥業(yè)股份有限公司。注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉購(gòu)自蘇州中化藥品工業(yè)有限公司。DL5000 marker購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司。膠回收試劑盒購(gòu)自Biomiga公司。DNeasy Blood & Tissue Kit購(gòu)自QIAGEN公司。Go Taq qPCR Master Mix購(gòu)自上海睿安生物科技有限公司。微量注射器購(gòu)自上海高鴿工貿(mào)有限公司。5-6 周齡雄性 ICR 小鼠、高壓飼料、進(jìn)口墊料、小鼠籠等購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。全自動(dòng)腦立體定位儀、注射進(jìn)樣器、顱骨鉆等購(gòu)自Stoeltingde公司。

1.2 方法

1.2.1 載體的制備 首先制備和鑒定本研究中所涉及到的pUC57-minivector-EGFP 質(zhì)粒、AAV-ITR基因表達(dá)微載體和AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體。pUC57-minivector-EGFP 質(zhì)粒已經(jīng)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成，可以通過直接轉(zhuǎn)化sure 2大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后挑選單克隆菌落培養(yǎng)后進(jìn)行驗(yàn)證并擴(kuò)增，通過購(gòu)自Axygen公司的質(zhì)粒提取試劑盒抽提pUC57-minivector-EGFP 質(zhì)粒，并通過Not I單酶切鑒定。AAV-ITR基因表達(dá)微載體的制備需將Sf9 細(xì)胞培養(yǎng)處于指數(shù)增長(zhǎng)期至 2×106cells/mL時(shí)，按 MOI=2 加入兩種重組桿狀病毒P3代的 Baculovirus-inrep和Baculovirus-ITR-EGFP，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，抽提得到微載體，并通過電泳驗(yàn)證AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體與多聚體的存在。通過購(gòu)自Biomiga公司的膠回收試劑盒可回收AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體，并以Xho I單酶切鑒定AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體。

1.2.2 基因表達(dá)微載體轉(zhuǎn)染小鼠大腦皮層 參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［13-16］，選擇NMDA損傷動(dòng)物模型，應(yīng)用目前最廣泛的皮層以及紋狀體立體定向注NMDA致腦損傷模型。由文獻(xiàn)［13，15］可知，小鼠腦內(nèi)注射，注射量不得超過5 μL，因此，將注射的拷貝數(shù)縮減為4×1011。根據(jù)公式：樣品拷貝數(shù)（copies/μL）=樣品濃度（ng/μL）×10-9×6.02×1023（阿伏伽德羅常數(shù)）/樣品分子量（堿基對(duì)數(shù) bp×648），可計(jì)算4× 1011各樣品的注射量。將 5-6 周的 ICR 雄性小鼠隨機(jī)分成 3個(gè)組，每組20只，分別通過腦立體定位儀對(duì)小鼠進(jìn)行立體定向腦皮層注射pUC57-minivector-EGFP 質(zhì)粒、AAV-ITR基因表達(dá)微載體和5%的滅菌葡萄糖溶液。首先，麻醉小鼠，腹腔注射5%的水合氯醛（按0.1 mL/10 g，每只注射 0.3 mL，麻醉時(shí)間為2 h左右）。剪去頭部鼠毛，75%酒精消毒皮膚，沿中線切開頭皮長(zhǎng)約1.5 cm，用無菌棉簽棒蘸取H2O2分離骨膜，暴露顱骨骨縫。使用腦立體定位儀確定鉆孔位置：前囟后2.5 mm，中線右側(cè)0.5 mm，進(jìn)針深度2 mm，顱骨鉆開直徑約1 mm圓孔。使用皮升注射泵按照1 μL/min的速度注入5 μL溶液（4×1011相同拷貝數(shù)的pUC57-minivector-EGFP 質(zhì)粒、AAV-ITR基因表達(dá)微載體用量加入1 μL 轉(zhuǎn)染試劑后用 5%的滅菌葡萄糖溶液補(bǔ)至 5 μL），留針5 min后，緩慢拔針?？p合頭皮，肌注青霉素鈉（25 g重小鼠為300 000 U，首次每只注射0.2 mL，隨后每天注射0.1 mL，連續(xù)3 d）。將小鼠放回鼠籠，精心飼養(yǎng)。

大腦皮層表達(dá)效果及穩(wěn)定性檢測(cè)：上述各實(shí)驗(yàn)組中的小鼠分別于3 d、7 d、14 d、一個(gè)月和兩個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)各處死4只，斷頭，暴露出腦組織。其中一只取出完整的存在注射部位的右半腦，置于4%多聚甲醛中，用于制作切片觀察熒光比例，另外3只于注射部位取出約25 mg的腦組織，使用購(gòu)自QIAGEN公司的DNeasy Blood & Tissue Kit提取腦組織DNA用于做qPCR。做腦組織切片觀察熒光比例，同時(shí)為了更加準(zhǔn)確的分析，提取腦組織中的DNA通過Real-time PCR 分析二者的降解情況。

1.2.3 基因表達(dá)微載體轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌 將5-6 周的 ICR 雄性小鼠隨機(jī)分成4個(gè)組，每組16只，通過50 μL微量注射器將拷貝數(shù)為4×1010（由于AAVITR基因表達(dá)微載體單體由膠回收得到，得率較低，注射拷貝數(shù)縮減為4×1010）的pUC57-minivector-EGFP 質(zhì)粒、AAV-ITR基因表達(dá)微載體、AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體和5%的滅菌葡萄糖溶液注射入小鼠右后肢骨骼肌。

小鼠骨骼肌表達(dá)效果及穩(wěn)定性檢測(cè)：上述各實(shí)驗(yàn)組中的小鼠分別于3 d、7 d、15 d和一個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)分別處死4只，暴露出后肢骨骼肌，其中一只取出完整的存在注射部位的骨骼肌，置于4%多聚甲醛中，用于制作切片觀察熒光比例。另外3只于注射部位取出約25 mg的骨骼肌組織，使用購(gòu)自QIAGEN公司的DNeasy Blood & Tissue Kit提取腦組織DNA用于做qPCR。

1.2.4 制作石蠟切片及熒光顯微分析 將取材后以4%多聚甲醛溶液固定的小鼠右半腦和后肢骨骼肌進(jìn)行脫水，再經(jīng)純酒精和二甲苯各半的混合液浸漬1 h后轉(zhuǎn)入二甲苯中浸漬1 h來進(jìn)行透明，對(duì)透明后的材料進(jìn)行浸蠟處理。浸蠟完全后，將組織置于融化的固體石蠟中完成包埋。最后按4 μm厚度在小鼠腦組織注射部位及骨骼肌注射部位附近均勻切割蠟塊完成切片的制作。將切片按照注射的不同載體和時(shí)間標(biāo)號(hào)后置于熒光顯微鏡下觀察并拍攝熒光圖（激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 507 nm）。

1.2.5 Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析熒光切片 將拍攝得到的熒光圖通過 Image J（National institutes of health）測(cè)量其平均光密度值（Ostu 校準(zhǔn)方法）、組織熒光面積或平均灰度值，用以反映不同載體的表達(dá)強(qiáng)度。平均光密度值通過灰度圖黑白反轉(zhuǎn)后校正光密度并選擇合適的閾值，排除背景干擾，使得轉(zhuǎn)染成功的腦組織細(xì)胞被全部選中，統(tǒng)計(jì)出所選定細(xì)胞在圖片中的面積及其IOD（所選細(xì)胞光密度的總和）值。IOD值與細(xì)胞熒光面積的比值即為平均光密度值。組織熒光面積（area）或平均灰度值（Mean gray value）的統(tǒng)計(jì)方法與平均光密度值相似。再將所得數(shù)值進(jìn)行方差分析（SPSS 17.0 Inc，Chicago，USA）并繪制折線圖以比較各載體的表達(dá)效率。

1.2.6 Real-time PCR 比 較 分 析DNA存留分子數(shù)分別收取不同時(shí)間點(diǎn)各組載體注射的小鼠的腦組織或骨骼肌，然后用QIAGEN全基因組提取試劑盒進(jìn)行總 DNA 抽提。設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程合成一對(duì) EGFP 片段引物，上游引物5'-CGGAATTCATGGT GAGCAAGGGCGAGG-3'和下游引物 5'-GCTCTAGAT TACTTGTACAGCTCGTCCAT-3'以 SYBGreen 為熒光染料進(jìn)行 Real-time PCR，比較上述各載體的不同時(shí)間段的分子殘留量。并將所得各組數(shù)據(jù)以 表示，采用多個(gè)樣本均數(shù)間方差分析及兩兩比較的 t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)組內(nèi)不同時(shí)間段的比較與相同時(shí)間段內(nèi)各組間比較，可分析各載體在不同時(shí)間段內(nèi)的殘余分子量大小及不同載體間的降解情況，以比較上述3種載體在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 載體的鑒定

pUC57-minivector-EGFP 質(zhì)粒通過Not I單酶切鑒定，可得到約2 000 bp和2 700 bp兩條條帶，與預(yù)期相符（圖1-C）。通過電泳驗(yàn)證AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體與多聚體結(jié)果（圖1-A）顯示，2000與3 000 bp之間的條帶約為2.7 kb，與預(yù)期AAVITR基因表達(dá)微載體單體條帶大小相符，由于AAVITR基因表達(dá)微載體單體在細(xì)胞內(nèi)極易形成二聚體和多聚體，而在5 000-6 000 bp處的條帶則符合其二聚體5.4 kb的大小，由此推算得到其余條帶依次為三聚體以及多聚體。用Xho I單酶切鑒定，應(yīng)得到2 048 bp，670 bp的條帶，大小與預(yù)期相符（圖1-B）。

圖1 AAV-ITR基因微載體與pUC57-minivector-EGFP的鑒定

2.2 各載體注射小鼠腦部的結(jié)果分析

2.2.1 載體注射小鼠腦部的表達(dá)效率分析 在小鼠腦部注射4×1011copies的AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP后的3、7和14 d的腦組織切片熒光顯微鏡分析（圖2-I）顯示，可明顯看出pUC57-minivector-EGFP在14 d時(shí)的表達(dá)情況下降非常明顯，低于AAV-ITR基因表達(dá)微載體14 d時(shí)的表達(dá)，差異顯著（圖2-I中Cb、Cc），說明此時(shí)，pUC57-minivector-EGFP在小鼠組織中已大量降解。圖2-I D為小鼠腦部注射AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP一個(gè)月后的腦組織切片熒光顯微圖，由于圖2-I中D與圖2-I中的A、B、C所示切片不屬于同一批次且此次切片更接近于注射針孔，不能將其進(jìn)行共同比較。但是可以明顯看出一個(gè)月以后AAV-ITR基因表達(dá)微載體在小鼠腦組織中的表達(dá)效率依然較高且顯著高于pUC57-minivector-EGFP的表達(dá)。將通過熒光顯微境觀察拍攝得到的熒光圖（圖2-I中A、B、C）通過 Image J（National institutes of health）做半定量分析，測(cè)量其平均光度值（Ostu 校準(zhǔn)方法），用以反映不同載體的表達(dá)強(qiáng)度。將計(jì)算所得平均光密度值通過折線圖表示（圖2-II）?？梢悦黠@看出小鼠腦部注射AAV-ITR基因表達(dá)微載體后3 d（圖2-II中Ab）、7 d（圖2-II中Bb）和14 d（圖2-II中Cb）時(shí)AAV-ITR基因表達(dá)微載體表達(dá)情況均高于pUC57-minivector-EGFP的表達(dá)情況（圖2II中Ac、Bc、Cc），且AAV-ITR基因表達(dá)微載體的表達(dá)效果在7-14 d內(nèi)沒有明顯變化（圖2II中Bb、Cb），表明AAV-ITR基因表達(dá)微載體此段時(shí)間較為穩(wěn)定。由此可推斷AAV-ITR基因表達(dá)微載體較pUC57-minivector-EGFP 在小鼠大腦皮層中的表達(dá)效率更高且表達(dá)更穩(wěn)定。

2.2.2 Real-time分析大腦皮層中載體分子的殘余量 4×1011copies的AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP在小鼠腦部不同時(shí)間段的表達(dá)Real-time PCR 分析結(jié)果（表1）顯示，AAV-ITR基因表達(dá)微載體的CT值在3、7、14、30和60 d的時(shí)間點(diǎn)均小于pUC57-minivector-EGFP，說明AAVITR基因表達(dá)微載體轉(zhuǎn)染效果較pUC57-minivector-EGFP更好，大腦皮層內(nèi)殘余分子數(shù)量更多。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，pUC57-minivector-EGFP和AAV-ITR基因表達(dá)微載體的CT值均有逐漸增加的趨勢(shì)。pUC57-minivector-EGFP在14 d時(shí)的CT值已基本接近空白對(duì)照，AAV-ITR基因表達(dá)微載體在兩個(gè)月時(shí)的CT值與空白對(duì)照相比仍有差異。可初步判斷pUC57-minivector-EGFP和AAV-ITR基因表達(dá)微載體在腦組織中的殘余分子數(shù)量在60 d內(nèi)均有不同程度的降解，但AAV-ITR基因表達(dá)微載體在小鼠腦組織中比pUC57-minivector-EGFP具有更高的轉(zhuǎn)染效率，而且AAV-ITR基因表達(dá)微載體在小鼠腦組織中要更加穩(wěn)定，不易降解。

圖2 AAV-ITR基因表達(dá)微載體、pUC57-minivector-EGFP注射小鼠大腦皮層的EGFP表達(dá)（I）及平均光密度值（II）

對(duì)表1中的小鼠腦組織中AAV-ITR基因表達(dá)微載 體、pUC57-minivector-EGFP 3、7、14、30和 60 d的殘留分子數(shù)RT-PCR所得的CT值分別使用函數(shù)TTEST進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果（表2）顯示，小鼠腦組織中的pUC57-minivector-EGFP 和AAV-ITR基因表達(dá)微載體殘余分子數(shù)量在注射后3-7 d的時(shí)間段內(nèi)的t檢驗(yàn)所得數(shù)值表明在此時(shí)間段內(nèi)小鼠腦組織中的pUC57-minivector-EGFP 和AAV-ITR基因表達(dá)微載體殘余分子數(shù)量的下降量并無顯著差異。在3-14 d的時(shí)間段內(nèi)，小鼠腦組織中的AAV-ITR基因表達(dá)微載體殘余分子數(shù)量下降有顯著的差異，而pUC57-minivector-EGFP的殘余分子數(shù)量下降極其顯著。由表3可以明顯的看出AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP在小鼠腦部直到14 d時(shí)的轉(zhuǎn)染效率與空白相比分別有極顯著差異和無明顯差異。AAV-ITR基因表達(dá)微載體在小鼠腦部的殘余分子數(shù)量在30 d時(shí)與空白對(duì)照依然有著顯著差異，表明AAV-ITR基因表達(dá)微載體相對(duì)于pUC57-minivector-EGFP有著更高的轉(zhuǎn)染效率和更好的穩(wěn)定性。

表1 小鼠腦組織中AAV-ITR基因表達(dá)微載體、pUC57-minivector-EGFP殘留分子數(shù)RT-PCR的CT值

表2 小鼠腦組織中AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP各時(shí)間段的RT-PCR的CT值分析

2.3 各載體注射小鼠骨骼肌的結(jié)果分析

2.3.1 載體注射小鼠骨骼肌的表達(dá)效率分析 小鼠骨骼肌注射AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體、AAVITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP后3、7和15 d組織切片熒光顯微境觀察拍攝得到的熒光圖片（圖3-I），通過 Image J（National institutes of health）處理，調(diào)整閾值范圍，使得轉(zhuǎn)染成功的肌肉組織被全部標(biāo)記，勾選軟件測(cè)量工具中的面積統(tǒng)計(jì)功能，統(tǒng)計(jì)出被標(biāo)記的肌肉組織面積以充分說明各微載體的轉(zhuǎn)染效率（圖3-II）。或者通過計(jì)算其平均灰度值來表示不同載體的表達(dá)強(qiáng)度（圖4）。結(jié)果顯示，骨骼肌注射后3 d時(shí)AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體的表達(dá)量（圖3-II中Ab）明顯高于AAVITR基因表達(dá)微載體（圖3-II中Ac）和pUC57-minivector-EGFP（圖3-II中Ad）。而此時(shí)AAV-ITR基因表達(dá)微載體的表達(dá)量（圖3II中Ac）同pUC57-minivector-EGFP（圖3-II中Ad）相當(dāng)，這點(diǎn)從其灰度值分析（圖4中Ac、Ad）也能很好的體現(xiàn)。7 d時(shí)AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體的表達(dá)量（圖3-II中Bb）有一定程度地降低，但仍然明顯高于AAVITR基因表達(dá)微載體（圖3-II中Bc），此時(shí)pUC57-minivector-EGFP的表達(dá)量已顯著降低（圖3-II中Bd）。15 d時(shí)AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體的表達(dá)量依然較高（圖3-II中Cb），此時(shí)pUC57-minivector-EGFP（圖3-II中Cd）和AAV-ITR基因表達(dá)微載體（圖3-II中Cc）大部分已降解。計(jì)算平均灰度值分析結(jié)果也明顯表示出AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體在3、7和15 d（圖4中Ab、Bb、Cb）時(shí)均保持較高水平，且明顯高于AAV-ITR基因表達(dá)微載體（圖4中Ac、Bc、Cc）和pUC57-minivector-EGFP（圖4中Ad、Bd、Cd）。充分表明AAV-ITR基因表達(dá)微載體與pUC57-minivector-EGFP相比表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)且轉(zhuǎn)染效率更好，但卻不及AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體。

表3 AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP注射不同時(shí)間后的RT-PCR的CT值分析

圖3 AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體、AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP注射小鼠骨骼肌EGFP表達(dá)結(jié)果（I）及EGFP成功表達(dá)的骨骼肌面積（II）

2.3.2 Real-time分析骨骼肌中載體分子的殘余量 為了比較AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性是否優(yōu)于AAV-ITR基因表達(dá)微載體，將4×1010copies的AAV-ITR基因表達(dá)微載體及其單體和pUC57-minivector-EGFP注射入小鼠骨骼肌后3、7、15和30 d后對(duì)其進(jìn)行Realtime PCR。所得CT值結(jié)果（表4）顯示，AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體、AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP在30 d內(nèi)CT都有較為明顯的增長(zhǎng)，AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體增長(zhǎng)幅度較低，且各時(shí)間段CT值均最低，前7 d內(nèi)CT值無明顯變化，一個(gè)月后，其數(shù)值仍低于空白對(duì)照。AAVITR基因表達(dá)微載體30 d內(nèi)增加幅度次之，一個(gè)月后，其數(shù)值與空白對(duì)照相當(dāng)。pUC57-minivector-EGFP的CT值增加更加明顯，一周時(shí)已與空白對(duì)照無明顯差異?？梢猿醪脚袛郃AV-ITR基因表達(dá)微載體單體相比于AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP具有更好的穩(wěn)定性，更加不易降解。

圖4 AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體、AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP注射小鼠大腦皮層EGFP表達(dá)灰度值

為了進(jìn)一步說明AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性是否優(yōu)于AAVITR基因表達(dá)微載體，將4×1010copies的AAV-ITR基因表達(dá)微載體及其單體和pUC57-minivector-EGFP注射入小鼠骨骼肌后3、7、15和30 d的Real-time PCR所得CT值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析。表5顯示，在小鼠肌肉注射后的3-7 d的時(shí)間段內(nèi)，AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體在小鼠骨骼肌中殘余分子數(shù)量沒有下降；AAV-ITR基因表達(dá)微載體的殘余分子數(shù)量有顯著下降；pUC57-minivector-EGFP的殘余分子數(shù)量下降極顯著。從表6中可以明顯的看出AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體在小鼠骨骼肌中的殘余分子數(shù)量在注射后一個(gè)月時(shí)與空白相比仍然有著極顯著差異，而AAV-ITR基因表達(dá)微載體在15 d時(shí)與空白已表現(xiàn)出顯著差異。AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體與AAV-ITR基因表達(dá)微載體相比隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，雖然差異有所減小，但是在一個(gè)月時(shí)仍有著顯著差異，而與pUC57-minivector-EGFP相比，30 d內(nèi)的各個(gè)時(shí)間段均有著極顯著的差異。由此可以充分表明AAVITR基因表達(dá)微載體在小鼠骨骼肌中雖然比pUC57-minivector-EGFP有著更好的穩(wěn)定性和更高的表達(dá)效率，但卻均不及AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體。

表4 小鼠骨骼肌中AAV-ITR基因表達(dá)微載體、pUC57-minivector-EGFP 的殘留分子數(shù)RT-PCR的CT值

3 討論

目前，病毒基因表達(dá)載體是用于基因治療的主要基因表達(dá)載體，AAV病毒載體在基因治療中得到廣泛應(yīng)用［18-20］。通過腺相關(guān)病毒本身結(jié)構(gòu)方面所具有的優(yōu)越性［21-23］和線性共價(jià)閉合微環(huán)狀DNA 載體［24-26］的構(gòu)造特點(diǎn)。構(gòu)建出AAV-ITR 單鏈 DNA 微載體，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且安全高效等優(yōu)點(diǎn)［27］。AAVITR單鏈DNA微載體高效表達(dá)效率的主要因素在于微載體兩端的AAV-ITR結(jié)構(gòu)。AAV-ITR為一段125 bp的核苷酸序列，能自我互補(bǔ)形成倒T型發(fā)卡結(jié)構(gòu)。末端所形成的穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得整個(gè)微載體的結(jié)構(gòu)更加的穩(wěn)定［23］，末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ITR不僅可以引發(fā)AAV單鏈基因組合成第二條鏈，還可幫助其在細(xì)胞中形成穩(wěn)定的環(huán)狀多聚體和類染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而使外源基因能穩(wěn)定表達(dá)，所以 ITR 結(jié)構(gòu)的存在又賦予此載體較高的穩(wěn)定性和表達(dá)效率［28］。

表5 小鼠骨骼肌中AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體、微載體和pUC57-minivector-EGFP各時(shí)間段的RT-PCR的CT值分析

表6 AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體、微載體和pUC57-minivector-EGFP注射后的RT-PCR的CT值分析

但是由于制備得到的AAV-ITR基因表達(dá)微載體是單體、二聚體以及多聚體的混合物，轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞之后，單聚體可以更快的進(jìn)行表達(dá)，而二聚體以及多聚體的存在使微載體DNA降解比質(zhì)粒降解要緩慢持續(xù)時(shí)間更久。本研究通過對(duì)AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP在小鼠大腦皮層的表達(dá)結(jié)果分析可以明顯看出，14 d時(shí)AAV-ITR基因表達(dá)微載體的降解有著顯著差異，而pUC57-minivector-EGFP的降解差異極顯著，此時(shí)pUC57-minivector-EGFP與空白對(duì)照已無明顯差異。AAVITR基因表達(dá)微載體在一個(gè)月時(shí)與空白相比還有顯著差異，兩個(gè)月時(shí)雖然差異不顯著但仍然有著一定的差異?？梢猿浞终f明AAV-ITR基因表達(dá)微載體在小鼠大腦皮層中比pUC57-minivector-EGFP有更高的穩(wěn)定性和更好的表達(dá)效率。AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體、AAV-ITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP在小鼠骨骼肌中的表達(dá)結(jié)果分析表明，在一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，pUC57-minivector-EGFP最早在一周時(shí)已顯示出與空白對(duì)照無明顯差異，AAVITR基因表達(dá)微載體在半個(gè)月時(shí)還表現(xiàn)出與空白對(duì)照的顯著差異，而AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體直到一個(gè)月時(shí)仍然與空白對(duì)照有著極顯著差異。而且，在同時(shí)間段內(nèi)，AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體的CT值總是最低。由此可見，AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體在體內(nèi)的表達(dá)效率和穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于AAVITR基因表達(dá)微載體和pUC57-minivector-EGFP質(zhì)粒。分析其原因，可能是由于二聚體與多聚體兩端的AAV-ITR結(jié)構(gòu)處于線性狀態(tài)，不易形成倒T型發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在動(dòng)物體內(nèi)主要以游離狀態(tài)存在，對(duì)其穩(wěn)定性有一定的影響。而單體在動(dòng)物體內(nèi)以 ITR 3'末端作為引物合成第二條鏈，形成一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。此外還有可能通過末端重復(fù)序列進(jìn)一步形成環(huán)狀多聚體，提高載體的穩(wěn)定性。所以，AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體在體內(nèi)的表達(dá)效率和穩(wěn)定性均更有優(yōu)越性。但是由于實(shí)驗(yàn)中AAV-ITR基因表達(dá)微載體單體必須通過膠回收得到，收率較低。目前已有報(bào)道可以在酵母和昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)制備AAV-ITR 單鏈 DNA［29，30］，后續(xù)實(shí)驗(yàn)除了進(jìn)一步研究AAV-ITR基因表達(dá)微載體的價(jià)值外，還將著力研究如何能有效的避免多聚體的生成，得到含量更高的單體。

4 結(jié)論

通過本研究充分證明了AAV-ITR基因表達(dá)微載體是一種具有較高轉(zhuǎn)染、表達(dá)效率以及穩(wěn)定性高的基因轉(zhuǎn)移載體。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Gene Expression of AAV-ITR Mini Vector in Mice vivo

LI Tai-ming1XU Qi-lin1PAN Jun-jie2LIU Xiao-mei2ZHANG Chun2
（1. School of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009；2. Key Laboratory of Biomedical Inspection Technology，Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology，Chinese Academy of Sciences，Suzhou 215163）

In order to compare the expression difference between AAV-ITR expression mini vector and its monomers in different parts of mice，the same copy number of AAV-ITR mini vector and pUC57-minivector-EGFP were separately transferred into the brain of mice. In addition，the same copy number of monomers of AAV-ITR mini vector and pUC57-minivector-EGFP were transferred into mouse skeletal muscle，and the number of residual molecules were compared in the different tissues at different periods. Analysis by florescence quantitative PCR，microscope observation，average optical density，and gray value showed that monomers of AAV-ITR mini vector in the same copy number had higher transfection efficiency and more stable than AAV-ITR mini vector and pUC57-minivector-EGFP. The comprehensive results suggest that the monomers of AAV-ITR mini vector present the feature of efficient，secure and stable expression，which may be expected to become a novel，secure，reliable，stable，and efficient vector in gene therapy.

gene therapy；gene expression mini vector；adeno-associated virus（AAV）；RT-PCR；skeletal muscle section

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.033

2015-08-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81371670） ，江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20140381）

李泰明，女，博士，研究方向：對(duì)糖尿病有治療作用的功能肽研究；E-mail：taimingli@163.com

劉曉玫，女，博士，研究方向：基因治療；E-mail：liuxm@sibet.ac.cn

張春，男，博士，研究方向：基因治療；E-mail：zhangchun@sibet.ac.cn