呂思行，明飛平，夏楓耿，鮑志寧，夏沈華

(廣州市微生物研究所 廣東廣州510663)

一株根霉菌的特性初探

呂思行，明飛平，夏楓耿，鮑志寧，夏沈華

(廣州市微生物研究所 廣東廣州510663)

利用土豆瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，對一株從酒曲中分離純化得到的菌株(編號：Rh101菌株)進行了分離培養(yǎng)。首先對Rh101菌株的生長速度、菌落特征、菌絲及分生孢子形態(tài)特征進行觀察。同時，探討不同溫度對Rh101菌株菌絲生長量和產(chǎn)酶量的影響。通過觀測Rh101菌株形態(tài)特征，初步鑒定Rh101菌株為根霉菌(Rhizopus)；綜合得出當溫度控制在20～25,℃時Rh101菌株的菌絲生長量及產(chǎn)酶量最佳。討論了Rh101菌株在發(fā)酵工業(yè)中對溫度的適應(yīng)性，為今后發(fā)酵工業(yè)菌株選育和條件控制等奠定基礎(chǔ)。

根霉菌 鑒定 溫度 生長狀況 酶活力

根霉菌(Rhizopus)有多個種，在自然界分布較廣，由于其淀粉酶活性很強，在釀造工業(yè)中常作為糖化菌。[1]根霉菌屬于絲狀真菌，影響絲狀真菌的因素很多，主要包括：培養(yǎng)基成分、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、表面活性劑等。本文主要通過形態(tài)鑒定一株根霉菌Rh101，再從培養(yǎng)溫度這個方面研究Rh101菌絲生長及糖化型淀粉酶活力的最佳溫度。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

Rh101為從酒曲中分離純化得到的菌株。

1.2 培養(yǎng)基

土豆瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 菌株的分離篩選提純

取樣裝于有適量無菌水的三角瓶中，振蕩分散孢子后再作適量稀釋，按平板分離法操作，在土豆培養(yǎng)基上28,℃恒溫培養(yǎng)12,h后出現(xiàn)無數(shù)條放射狀菌絲開始緩慢伸展，然后用接種針截取菌絲的尖部，移植到平板上，如此反復(fù)移植幾次后，形成純菌株，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)保存供試驗用。

1.3.1 生長情況的觀察

將分離純化后培養(yǎng)1～2,d的根霉菌絲平板，用打孔器取出圓形小塊各接種于3個大培養(yǎng)平板中培養(yǎng)。由于根霉菌生長是由平板中心向周圍輻射生長，每隔1,d記錄培養(yǎng)皿底部根霉菌菌落直徑可以反映菌株的生長速度。由于根霉3,d可以長滿整個平板，因此試驗過程中采用2,d測定菌落直徑來計算平板Rh101菌落的生長速度。計算公式如下：

菌絲生長速度＝菌落直徑/生長天數(shù)

1.3.2 觀察記錄PDA平板的Rh101菌落形態(tài)的特征1.3.3 掃描電鏡的制樣

按照文獻[2]報道的方法制樣，在掃描電鏡(Scanning electron microscopy，SEM)下觀察菌株形態(tài)。

1.4 菌絲干重測定

用打孔法將PDA平板的菌絲接種于100,mL PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別放于15,℃、20,℃、25,℃、30,℃、35,℃，轉(zhuǎn)速為140,r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5,d，每個溫度3個重復(fù)。將不同溫度下液體搖瓶培養(yǎng)5,d的Rh101發(fā)酵物，過濾得到菌絲體，60,℃烘48,h，稱量得到菌絲干重。

1.5 糖化型淀粉酶測定

按照1.4操作得到液體搖瓶培養(yǎng)物，過濾所得濾液參考文獻[3]，對除去菌絲的發(fā)酵液稀釋50倍后進行糖化型淀粉酶活力測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rh101生長量測定

利用PDF固體培養(yǎng)基對Rh101進行培養(yǎng)，1,d菌落直徑為2.78,cm，培養(yǎng)2,d菌落直徑為6.21,cm，3,d后長滿整個平板，菌落最終直徑為9,cm。菌落生長速度為1.29,cm。

2.2 Rh101菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)

Rh101菌落形態(tài)(見圖1)為白色，棉絮般生長，匍匐菌絲生長粗壯，孢子在第3,d開始生長，孢子量大，到后期可見培養(yǎng)基頂蓋布滿黑色產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。從圖2看出，Rh101菌絲無假根，菌絲白色，菌叢直立，孢子囊為頂生球形。圖3可見單生孢子囊，孢子囊呈球形或近球形，有囊托，孢子囊成熟后呈黑色，內(nèi)含孢子呈橢圓形。

圖1 Rh101培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Morphological characteristics of Rh101 on PDA plate

圖2 Rh101 在掃描電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2Morphology of Rh101 under scanning electron microscope

圖3 Rh101孢子囊在掃描電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.3The morphological structure of the sporangium under scanning electron microscopy

2.3 溫度對Rh101菌絲干重的影響

圖4 溫度對Rh101菌絲干重的影響Fig.4The influence of temperature on Rh101 mycelial dry weight

由圖4可知，Rh101在溫度20,℃左右搖瓶時獲得菌絲干重最大，在25,℃時菌絲干重略有下降，最后隨著溫度的不斷提高Rh101菌絲干重呈快速下降。這說明Rh101菌絲生長較適宜的溫度在20～25,℃之間。

2.4 溫度對Rh101糖化型淀粉酶活力的影響

測定結(jié)果如圖5所示，可知Rh101糖化型淀粉酶在25,℃時活力最高，各液體培養(yǎng)基中Rh101從15～30,℃糖化型淀粉酶活力穩(wěn)定，變化不大。但是當溫度超過30,℃時，Rh101糖化型淀粉酶活力快速下降。這說明Rh101在20～30,℃時，有利于Rh101糖化型淀粉酶發(fā)揮作用。

圖5 溫度對Rh101糖化型淀粉酶活力的影響Fig.5 The influence of temperature on Rh101 saccharifying amylase activity

3 討 論

通過對酒曲中菌株Rh101的分離，對其在PDA培養(yǎng)基上的生長速度、菌落形態(tài)特征及在掃描電鏡下對Rh101的生殖器官孢子囊、分生孢子形態(tài)進行了觀察研究，通過形態(tài)學(xué)方法鑒定出Rh101為根霉菌。

廣州地處亞熱帶沿海，北回歸線從中南部穿過，夏季長，全年平均氣溫20～22,℃。因此在廣州進行菌種研究，溫度成為一個至關(guān)重要的因素。本次通過研究Rh101在不同的培養(yǎng)溫度下其菌絲生長量及糖化性淀粉酶的情況，最終測定出Rh101菌絲生長較適宜的溫度在20～25,℃之間，糖化型淀粉酶活力在20～30,℃最佳。綜合兩方面因素得出Rh101在20～25,℃的培養(yǎng)條件下既能保障菌絲生長量，也能兼顧糖化型淀粉酶活力。這為Rh101進一步開發(fā)應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)提供了研究基礎(chǔ)?！?/p>

［1］ Schipper M A A，Stalpers J A A. Revision of the genus Rhizopus [J]. Stud. Mycol. ，1984(25)：1-34.

［2］ 劉吉平，呂思行，米紅霞. 生物防治白僵菌與家蠶病原白僵菌的生物學(xué)特性初步比較[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2011，37(3)：442-448.

［3］ 李憲臻，張宇，金鳳燮. 兩株曲霉糖化性質(zhì)的比較研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，1994(6)：42-46.

The Characteristics of a Strain of Rhizopus

LV Sixing，MING Feiping，XIA Fenggeng，BAO Zhining，XIA Shenhua
(Guangzhou Microbiology Research Institute，Guangzhou 510663，Guangdong Province，China)

A strain(No．Rh101)was isolated using PDA medium from the distiller’s yeast．In the paper，growth rate，colony characteristics，mycelium and conidium morphology of Rh101 strains were observed．Then，different temperatures on Rh101 strain hypha growth and the influence of the amount of enzyme production were discussed．The results show that Rh101 strain is Rhizopus and the best temperature on the growth and enzyme production is between 20,℃and 25,℃．The application of strain under different temperatures was discussed，which may lay a foundation for the fermented food strain breeding and fermentation conditions controlling.

Rhizopus；identify；temperature；growth state；enzyme activity

S476.12

：A

：1006-8945(2016)12-0028-02

廣東省省級科技計劃項目(項目編號：2015B040403004)。

2016-11-04