孫　蕊，詹冬梅 ，艾炳蔚

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京　210023；2.鹽城市第三人民醫(yī)院，江蘇 鹽城　224005；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京　210029)

電針對ApoE-/-小鼠肝臟PPARα與TNF-α蛋白表達(dá)的影響

孫蕊1，詹冬梅2，艾炳蔚3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210023；2.鹽城市第三人民醫(yī)院，江蘇 鹽城224005；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京210029)

[摘要]目的探討電針對載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠肝臟過氧化物酶體增殖劑激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)蛋白表達(dá)的影響。方法將30只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組、藥物組及電針組，每組10只。采用高脂飼料喂養(yǎng)14周的方法復(fù)制高脂血癥模型。電針組小鼠接受單側(cè)神門、內(nèi)關(guān)、足三里、三陰交電針，藥物組小鼠每日接受40 mg/kg辛伐他汀灌胃。免疫組織化學(xué)法檢測肝臟中PPARα、TNF-α的表達(dá)，采用Western blot檢測肝臟PPARα的蛋白表達(dá)。結(jié)果電針組小鼠肝臟中PPARα的蛋白表達(dá)水平高于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，肝臟TNF-α表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。與模型組比較，電針組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)小顆粒脂滴減少，肝細(xì)胞凋亡和壞死減少，且肝細(xì)胞保存相對完整。結(jié)論電針通過抑制炎性因子的表達(dá)而減少脂質(zhì)沉積，治療動脈硬化。

[關(guān)鍵詞]動脈粥樣硬化；高脂血癥；電針；PPARα；TNF-α

動脈硬化(atherosclerosis，AS)已嚴(yán)重危害人類健康，是心腦血管病的病理基礎(chǔ)。AS的發(fā)展過程非常復(fù)雜，其發(fā)生與動脈內(nèi)膜的損傷、脂質(zhì)浸潤、單核細(xì)胞的侵入、平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、斑塊的破裂、血管的堵塞以及微循環(huán)障礙等因素有關(guān)。現(xiàn)代研究證實(shí)，電針療法對AS的發(fā)生發(fā)展具有防治作用[1]。電針療法作用途徑多樣，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善血流動力學(xué)，抑制炎癥等作用[2-3]。

本次實(shí)驗(yàn)采用動物模型為載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠。相關(guān)研究[4]證實(shí)，ApoE-/-小鼠由于對富含膽固醇的脂蛋白清除障礙，導(dǎo)致總膽固醇、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白水平升高，這種小鼠無論是正常飲食還是高脂飲食均可形成嚴(yán)重高脂血癥，并自發(fā)形成AS斑塊，其斑塊的分布及病理特征與人類AS斑塊的分布均十分相似，目前是國內(nèi)外公認(rèn)的研究AS較好的動物模型。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物38只6周齡、健康的ApoE-/-雄性小鼠，平均體質(zhì)量為22.1 g，飼養(yǎng)于南京大學(xué)模式動物研究所實(shí)驗(yàn)動物房屏障環(huán)境內(nèi)。小鼠生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2010-0001，動物房合格證號為SYXK(蘇)2010-0003，由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司提供小鼠清潔級飼料，飼料的合格證號是蘇飼審(2008)01008；飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24 ℃，相對濕度50%～70%，光照時間8:00—20:00。

1.2主要儀器辛伐他汀膠囊(商品名：舒降之)，每片20 mg，杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)；韓氏穴位神經(jīng)刺激治療儀200E；中研太和針灸針(直徑0.16 mm，長7 mm)；針灸治療固定器；DSCN 3852電子秤；上海寶賽離心機(jī)Microcl-17；華東電子DG5033A酶標(biāo)儀；上海躍進(jìn)電熱恒溫干燥箱；徠卡EG1150石蠟包埋機(jī)；徠卡RM2235石蠟切片機(jī)；奧林巴斯病理切片掃描系統(tǒng)；國華HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.3主要試劑腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、過氧化物酶體增殖劑激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)、兔抗鼠一抗：均購自英國Abcam公司。

2方法

2.1治療方法模型復(fù)制期間，給予小鼠喂食高脂高膽固醇飲食(含21%脂肪、1.25%膽固醇)，14周持續(xù)喂養(yǎng)，隨機(jī)選擇3只小鼠處死，通過觀察主動脈竇蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色結(jié)果來確認(rèn)高脂血癥模型是否復(fù)制成功。ApoE-/-小鼠高脂血癥模型復(fù)制成功后，治療11周。模型組：每日灌胃蒸餾水10 mL/kg；針灸治療固定器上隔日固定10 min。藥物組：辛伐他丁每日40 mg/kg，10 mL/kg灌胃，每日灌胃1次；針灸治療固定器上隔日固定10 min。電針組：電針針刺小鼠“內(nèi)關(guān)”“神門”“后三里”“三陰交”，電針采用疏密波，頻率為2/15 Hz，電流輸出大小為0.3 mA，針刺時間為10 min，每次電針單側(cè)，交換進(jìn)行，隔日治療1次；每日灌胃蒸餾水10 mL/kg。以上針刺穴位按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]定位標(biāo)準(zhǔn)治療。

2.2組織取材小鼠在11周治療結(jié)束后，分別在禁食12 h后打開胸腹腔，取主動脈和肝臟后，將主動脈和部分肝臟用石蠟包埋。隨機(jī)在包埋主動脈竇的石蠟包塊中選擇2個相距50 μm的觀測點(diǎn)，應(yīng)用徠卡RM2235石蠟切片機(jī)連續(xù)5張切片，厚度6 μm；肝臟石蠟包塊連續(xù)切片，厚度6 μm。各組小鼠主動脈竇石蠟切片，行HE染色，400倍光鏡下觀察主動脈竇的斑塊形態(tài)結(jié)構(gòu)。肝臟石蠟切片用于檢測TNF-α、PPARα的表達(dá)水平。

2.3實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測方法

2.3.1免疫組織化學(xué)法檢測TNF-α、PPARα表達(dá)水平將肝組織石蠟切片放置在恒溫箱中烘烤后，置于不同濃度的二甲苯、乙醇浸泡，3% H2O2去離子水孵育，蒸餾水沖洗后用PBS浸泡；蒸鍋抗原修復(fù)，自然冷卻后，用山羊血清封閉液封閉；滴加適當(dāng)比例一抗，4 ℃過夜后滴加二抗，室溫下孵育后用PBS浸洗；滴加1∶100鏈霉素卵白素，室溫下孵育；DAB顯色后，蘇木精復(fù)染，蒸餾水浸洗，梯度脫水，透明，封片，光鏡下檢測，以肝腺泡3區(qū)內(nèi)單位視野(80 μm×80 μm)下表達(dá)PPARα和TNF-α蛋白的肝細(xì)胞數(shù)作為PPARα和TNF-α的表達(dá)水平。

2.3.2Western blot法檢測肝臟PPARα的相對表達(dá)水平肝組織總蛋白提取后，將組織蛋白定量，在SDS-PAGE中電泳，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，測定光密度值，計算PPARα蛋白的相對表達(dá)水平。

3結(jié)果

3.13組ApoE-/-小鼠主動脈竇形態(tài)學(xué)變化模型組與藥物組主動脈竇內(nèi)膜下出現(xiàn)斑塊，且斑塊中有明顯增厚脂質(zhì)沉積，并見大量壞死核、大量膽固醇結(jié)晶體以及脂核和斑塊鈣化區(qū)；纖維帽較薄弱，斑塊不穩(wěn)定。電針組內(nèi)膜下也出現(xiàn)斑塊，并見大量泡沫細(xì)胞，及較少量膽固醇結(jié)晶體、鈣化，且纖維帽較厚。見圖1。結(jié)果提示電針可減少膽固醇沉積，穩(wěn)定斑塊，減緩AS進(jìn)程。

注:A.模型組;B.藥物組;C.電針組。圖1 3組ApoE-/-小鼠主動脈竇形態(tài)學(xué)變化(10×40倍,HE染色)

3.2免疫組織化學(xué)法檢測的3組ApoE-/-小鼠肝臟PPARα、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較陽性染色的PPARα和TNF-α蛋白為淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。模型組肝腺泡3區(qū)肝細(xì)胞核免疫組織化學(xué)法染色后呈現(xiàn)淡藍(lán)色、大而圓，部分細(xì)胞出現(xiàn)雙核和多倍體核；肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大顆粒脂滴，細(xì)胞核被擠壓和移位；同時有大量肝細(xì)胞的凋亡和壞死。藥物組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴分布密集，顆粒較大。電針組肝腺泡3區(qū)肝細(xì)胞核免疫組織化學(xué)染色后呈現(xiàn)淡藍(lán)色，部分肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小顆粒脂滴，未有大量肝細(xì)胞的凋亡和壞死，且肝細(xì)胞保存相對完整。見圖2和圖3。3組PPARα蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，χ2=5.71，P=0.058)，但針刺組PPARα蛋白表達(dá)水平較模型組和藥物組呈現(xiàn)增多趨勢。3組TNF-α蛋白表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F(2，27)=4.76，P=0.017)，電針組TNF-α表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

注:A.模型組;B.藥物組;C.電針組。圖2 3組ApoE-/-小鼠肝腺泡3區(qū)內(nèi)PPARα蛋白表達(dá)水平比較(10×40倍,免疫組織化學(xué)染色)

注:A.模型組;B.藥物組;C.電針組。圖3 3組ApoE-/-小鼠肝腺泡3區(qū)內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)水平比較(10×40倍,免疫組織化學(xué)染色)

表1　3組小鼠肝腺泡3區(qū)內(nèi)PPARα和

注：與模型組比較，*P<0.05。

3.3Western blot法檢測的3組ApoE-/-小鼠肝臟PPARα相對表達(dá)水平比較模型組(n=3)、藥物組(n=3)和電針組(n=3)PPARα的相對表達(dá)水平分別為(17.15±5.69)、(23.67±5.73)和(22.43±8.70)。3組PPARα相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F(2，6)=0.766，P=0.505)，電針組和藥物組PPARα相對表達(dá)水平較模型組有升高趨勢。見圖4。

圖4　3組ApoE-/-小鼠肝臟PPARα

4討論

4.1電針調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝在AS過程中，血脂異常是影響其發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險因素，PPARα對血脂具有良性的調(diào)節(jié)作用。在臨床試驗(yàn)中，PPARα的貝特類可以降低血漿三酰甘油水平，提高高密度脂蛋白膽固醇的水平。有研究[6]表明，經(jīng)非諾貝特治療后，冠狀動脈疾病患者體內(nèi)apoA-Ⅱ含量顯著增加，且PPARα的其他一些激動劑也可誘導(dǎo)人體apoA-Ⅱ的表達(dá)。apoA-Ⅰ與apoA-Ⅱ是高密度脂蛋白的重要組成部分，此外，也是參與膽固醇逆轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子，因此PPARα不僅可以調(diào)節(jié)高密度脂蛋白的水平，還間接影響膽固醇的逆轉(zhuǎn)錄。從本次研究結(jié)果來看，電針提高ApoE-/-小鼠肝臟表達(dá)PPARα的作用雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但是與其他兩組相比具有上升趨勢。且從肝臟的病理切片觀察來說，針刺組較模型組與藥物組小鼠肝細(xì)胞保存完整，脂滴數(shù)量較少。而其他兩組，尤其是模型組，肝細(xì)胞出現(xiàn)雙核和多倍體核；肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性，有大顆粒脂滴，細(xì)胞核被擠壓和移位；同時有大量肝細(xì)胞的凋亡和壞死。提示電針治療有利于提高PPARα的表達(dá)，其效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與療程短和針刺的刺激量不夠有關(guān)，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

4.2電針抑制炎癥炎癥在脂質(zhì)代謝的失衡中發(fā)揮重要作用，炎癥促進(jìn)細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取和蓄積，脂質(zhì)代謝的失衡也是細(xì)胞對炎癥的反應(yīng)。有研究[7]表明，針灸可抑制炎癥的進(jìn)展。PPARα具有抑制炎癥的作用，PPARα通過抑制核因子κB和活性蛋白-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)節(jié)cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白-H而實(shí)現(xiàn)抗炎作用。TNF-α是一種炎性因子，是促使AS發(fā)生發(fā)展的促炎性因子。血管內(nèi)皮損傷為AS形成的始動環(huán)節(jié)。有研究[8]證實(shí)，TNF-α對于血管內(nèi)皮的損傷具有促進(jìn)作用；同時，TNF-α可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖及平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成，而平滑肌細(xì)胞增殖及向內(nèi)膜下遷移是AS的主要病理特征之一。胡啟程等[9]研究表明，TNF-α破壞血管表面凝血與抗凝血平衡，促進(jìn)血栓形成；TNF-α還可增加基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)、MMP-9的表達(dá)，而MMP-2、MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定性增加，從而增加心腦血管病的風(fēng)險。 本次研究表明，電針對炎癥有明顯的抑制作用。故此可推測，電針對炎癥的抑制作用可能是通過上調(diào)PPARα而間接抑制炎癥通道的轉(zhuǎn)錄，即抑制炎癥發(fā)展的上游。同時，在炎癥因子發(fā)展中，也可對炎性因子有直接的抑制作用。電針可能作用于炎癥發(fā)展的各個過程，但是否還有其他因子的參與，以及對炎癥起直接作用還是間接作用，這些均需要進(jìn)一步研究。

4.3穴位的選擇內(nèi)關(guān)穴是治療胸痹的首選穴，是心包經(jīng)絡(luò)穴，可通竅醒神、通血脈、行氣血，針刺內(nèi)關(guān)可實(shí)現(xiàn)對心臟、血脈的調(diào)節(jié)作用。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，針刺內(nèi)關(guān)可增強(qiáng)心臟收縮，提高心輸出量，降低心肌耗氧，改善冠狀動脈循環(huán)，增加心肌血氧供給。神門穴是手少陰之俞，為原穴，有扶正祛邪、寧心安神的作用。內(nèi)關(guān)、神門合用，可起到降低血液黏稠度，抑制血小板聚集，降低血脂的作用[11]。補(bǔ)足三里能健脾，瀉足三里能平肝，針刺該穴有和胃健脾、通腑化痰、升降氣機(jī)的作用。三陰交為脾、腎、肝三經(jīng)交會之穴，刺之可健脾胃、益精氣、促運(yùn)化、升清降濁、除濕祛痰。有研究[12]證實(shí)，針灸三陰交和足三里，可增強(qiáng)膽固醇的分解和排泄，減少其合成和吸收，改變其在血漿和組織中的分布，從而降低血液中膽固醇含量。四穴合刺，標(biāo)本兼治，可達(dá)活血化瘀、調(diào)和氣血、通腑泄?jié)帷⒔∑⒗麧竦淖饔?，從而提高抗氧化能力和保護(hù)血管內(nèi)皮能力，以改善動脈粥樣硬化。

綜上所述，電針療法通過調(diào)節(jié)脂代謝、抑制炎癥等作用，有效抑制AS的發(fā)生發(fā)展。大量研究證實(shí)，針刺治療AS屬于整體療法，多靶點(diǎn)、多途徑作用于人體，通過發(fā)揮特異性和非特異性兩方面的效應(yīng)，達(dá)到治療、預(yù)防AS的目的。

參考文獻(xiàn)：

[1]孫遠(yuǎn)征，范秋玉.針?biāo)幗Y(jié)合治療皮質(zhì)下動脈硬化性白質(zhì)腦病的臨床觀察[J].針灸臨床雜志,2010,26(9):19-21.

[2]張海波，李迎新，胡甜甜，等.激光針灸對CIA大鼠血清IL-1β、IL-15、IL-17、TNF-α、VEGF和COR的影響[J].中國激光，2014，21(3):86-91.

[3]萬文蓉，趙銀龍，單敬文，等.健脾降脂方針刺治療單純性肥胖癥126例臨床研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(中醫(yī)臨床版),2013，11(6):23-27.

[4]徐道峰,謝東明.動脈粥樣硬化動物模型研究現(xiàn)狀[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,32(4):637-638.

[5]郭義，方劍橋.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012:51-212.

[6]Vu-Dac N, Schoonjans K, Kosykh V, et al. Retinoids increase human apolipoprotein A-11 expression through activation of the retinoid X receptor but not the retinoic acid receptor[J]. Mol Cell Biol,1996,16(7):3350-3360.

[7]Zhang K, Shen X, Wu J, et al. Endoplasmic reticulum stress activates cleavage of CREBH to induce a systemic inflammatory response[J].Cell, 2006,124(3):587-599.

[8]劉金波，鄧華聰，葛倩，等.脂聯(lián)素對TNF-α介導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006,5(3):1697-1699.

[9]胡啟程，孫文悅.動脈粥樣硬化患者血清腫瘤壞死因子的改變及氨氯地平對其影響[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2008,3(2):15-16.

[10]程施瑞，邵欣，梁繁榮，等.針灸治療冠心病心絞痛的臨床用穴規(guī)律分析[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,12(4):913-914.

[11]涂杰，梁東科，劉國鋒，等.電針內(nèi)關(guān)穴對大鼠體外循環(huán)后心功能的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015,14(3):360-363.

[12]徐福，宣麗華，張舒雁，等.針刺不同穴位組合降低血脂的臨床研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(3):557-559.

Effect of Electroacupuncture on Protein Expression of PPARα and TNF-α in Liver of ApoE-/-Mice

SUNRui1,ZHANDong-mei2,AIBing-wei3

(1.SecondSchoolofClinicalMedicine,NanjingUniversityofChineseMedicine,JiangsuNanjing210023,China; 2.TheThirdPeople’sHospitalofYancheng,JiangsuYancheng224005,China; 3.TheAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,JiangsuNanjing210029,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture on the protein expression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in the liver of ApoE-/-mice. MethodsA total of 30 ApoE-/-mice were randomly divided into model group, drug group, and electroacupuncture group, with 10 mice in each group. The model of hyperlipidemia was established by high-fat drink for 14 weeks. The mice in the electroacupuncture group were given electroacupuncture at Shenmen, Neiguan, Zusanli, and Sanyinjiao points, and those in the drug group were given simvastatin 40 mg/kg per day by gavage. Immunohistochemistry was used to measure the expression of PPARα and TNF-α in the liver, and Western blot was used to measure the protein expression of PPARα in the liver. ResultsCompared with the model group, the electroacupuncture group showed nonsignificantly higher protein expression of PPARα in the liver (P>0.05) and significantly lower expression of TNF-α in the liver (P<0.05). Compared with the model group, the electroacupuncture group had decreased small lipid droplets in the liver, reduced hepatocyte apoptosis and necrosis, and relatively complete hepatocytes. ConclusionElectroacupuncture can reduce liquid deposition through inhibiting the expression of inflammatory factors, so as to treat arteriosclerosis.

[Key words]Atherosclerosis; Hyperlipidemia; Electroacupuncture; Peroxisome proliferator-activated receptor alpha; Tumor necrosis factor alpha

基金項(xiàng)目：江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目(2011-WS047)

作者簡介：孫蕊(1990-)，女，碩士研究生

通信作者：艾炳蔚，aibingwei@163.com

[中圖分類號]R541.4；R246[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.019

(收稿日期：2016-02-21；編輯：姚實(shí)林)