張　威，徐春生，李傳富，劉軍平，武紅利

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥　230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)藥信息工程學(xué)院，安徽 合肥　230012)

針刺持續(xù)時間及刺激方案對針刺腦功能成像的影響

張威1，徐春生1，李傳富1，劉軍平1，武紅利2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)藥信息工程學(xué)院，安徽 合肥230012)

[摘要]目的利用BOLD-fMRI技術(shù)，在保持其他影響因素不變的情況下研究針刺持續(xù)時間及針刺刺激方案對腦功能成像激活區(qū)定位的影響。方法選取健康志愿者40例，平均分為2組，為持續(xù)時間組及刺激方案組，第1組采用相同的針刺刺激方案(改良組塊設(shè)計)進行3輪(R1、R2、R3)功能像數(shù)據(jù)采集，第2組采用3種不同的針刺刺激方案(包括典型組塊、改良組塊設(shè)計及事件相關(guān)設(shè)計)進行3輪功能像采集，兩組數(shù)據(jù)均采用相同的MR掃描參數(shù)，用AFNI軟件進行數(shù)據(jù)處理，用Monte Carlo閾值校正方法確定腦功能激活區(qū)，得出每組的組內(nèi)分析結(jié)果及組內(nèi)不同輪次比較的結(jié)果。 結(jié)果持續(xù)時間組及刺激方案組的組內(nèi)fMRI信號存在明顯差異。組內(nèi)不同輪次fMRI信號比較也均存在顯著差異的腦區(qū)，兩組的R2與R1相比均存在fMRI信號減低區(qū)域，但刺激方案組的R3與R1相比存在廣泛的fMRI信號減低區(qū)域，持續(xù)時間組的R3與R1相比存在fMRI信號增高區(qū)域。 結(jié)論針刺持續(xù)時間及刺激方案均會對腦功能成像的激活區(qū)定位產(chǎn)生影響。

[關(guān)鍵詞]功能性磁共振成像；腦；針刺；刺激方案；持續(xù)時間

近年來，許多學(xué)者利用功能性磁共振成像(functional magnetic resonance imaging, fMRI)在針刺的作用機制方面得出了許多有意義的結(jié)果，但不同學(xué)者得出的結(jié)果差異很大。這其中除了針刺腦功能成像方法學(xué)非常復(fù)雜外[1]，其他因素諸如針刺感覺、期望、穴位特異性、針刺時間變異性、針刺刺激類型也會對針刺腦功能成像的激活區(qū)定位產(chǎn)生影響[2-6]。只有更深入地研究這些影響因素，基于腦功能成像的結(jié)果才會更加真實可靠。針刺持續(xù)時間及刺激方案，作為與針刺效應(yīng)密切關(guān)聯(lián)的重要影響因素，尚未得到足夠的重視[7]。筆者擬通過針刺健康志愿者的雙側(cè)足三里穴(ST36)，研究針刺持續(xù)時間及針刺刺激方案對針刺腦功能成像結(jié)果的影響。筆者用電針代替手針，以盡量減少人為因素的影響，并且考慮到針刺的偏側(cè)性，選擇針刺雙側(cè)足三里穴。

1資料與方法

1.1實驗對象與分組研究對象共40例，均為20～30歲的在校大學(xué)生、研究生及醫(yī)護人員，在實驗前均自愿簽署知情同意書，無心腦血管疾病及精神疾病史，半年內(nèi)未接受過針刺治療及相關(guān)藥物服用史。將實驗對象隨機分為2組，每組20例，分別為持續(xù)時間組及刺激方案組，持續(xù)時間組均采用相同的S1方案進行3輪(R1、R2、R3)功能像采集，刺激方案組分別按照S1、S2、S3方案的順序進行3輪功能像數(shù)據(jù)采集，兩組的MR掃描參數(shù)及電針參數(shù)均相同。

1.2實驗設(shè)計根據(jù)實驗內(nèi)容和目標(biāo)的需要，共設(shè)計3種實驗設(shè)計方案，以下簡稱S1、S2、S3方案，見圖1。①S1方案：采用改良的組塊設(shè)計，先靜息2 min，然后電針刺激2 min，再靜息3 min，再刺激2 min，最后1 min靜息，功能像采集持續(xù)10 min共150個時間點。②S2方案：采用典型的組塊設(shè)計，先靜息2 min，然后電針刺激2 min，再靜息2 min，最后電針刺激2 min，功能像采集持續(xù)8 min共120個時間點。③S3方案：采用事件相關(guān)設(shè)計，針刺與靜息交替，針刺與靜息的時間按照隨機化原則設(shè)定，功能像采集持續(xù)12 min 4 s，共186個時間點。

注：S1為改良組塊設(shè)計，S2為典型組塊設(shè)計，S3為事件相關(guān)設(shè)計；TRs代表時間點數(shù)。

圖1S1、S2、S3針刺刺激方案示意圖

1.3數(shù)據(jù)采集實驗使用SIEMENS Symphony 1.5 T超導(dǎo)型磁共振掃描機，使用標(biāo)準(zhǔn)頭部線圈進行7個序列的掃描。①定位像。②T2加權(quán)像：用以排除顱內(nèi)病變。③第1輪任務(wù)態(tài)功能像掃描：采用回波平面成像序列(echo-planar imaging, EPI)，取與前后聯(lián)合的連線平行的橫軸位，重復(fù)時間(repetition time, TR)4 000 ms，回波時間(echo time, TE)50 ms，翻轉(zhuǎn)角(flip angle, FA)90°，層厚3 mm，層間距0.75 mm，掃描野(field of view, FOV) 192 mm×192 mm，分辨率64×64。④2D解剖像：采用自旋回波序列T1加權(quán)序列，采用與功能像相同的掃描位置，共36層，掃描范圍覆蓋全腦，TR/TE/FA 500 ms/12 ms/90°，F(xiàn)OV 230 mm×230 mm，層厚3.0 mm，層間距0.75 mm，分辨率192×144。⑤第2輪功能像掃描：除了所選擇的刺激方案不同，掃描參數(shù)與第一輪功能像一致。⑥3D解剖像：采用擾相梯度回波序列，取矢狀位，共176層，TR/TE/FA 2 100 ms/3.93 ms/13°，F(xiàn)OV 250 mm×250 mm，層厚1.0 mm，層間距0.5 mm，分辨率256×256。⑦第3輪功能像掃描：除了所選擇的刺激方案不同，掃描參數(shù)與第1輪功能像一致。

1.4實驗步驟讓志愿者在休息室更衣、休息，待全身放松后進入掃描室，以保持心理及生理狀態(tài)的穩(wěn)定；由專業(yè)的針灸科醫(yī)生針刺志愿者的雙側(cè)足三里穴，進針深度約2 cm，針刺得氣后，固定電針波形為連續(xù)波，頻率為2 Hz，然后將針灸針通過外接導(dǎo)線與磁共振操作室外的華佗牌SDZ-Ⅳ型電針儀相連，設(shè)定電針電流強度以不引起受試者產(chǎn)生不愉快的感覺為宜，強度為1 mA。囑受試者平躺、閉眼，用棉球塞耳，戴上專用隔音耳麥，固定頭部，以最大限度限制其頭動，關(guān)燈以減少視覺刺激，囑受試者在掃描過程中保持頭部靜止，盡量避免心理活動，實驗結(jié)束后對受試者進行反饋，記錄受試者的針刺感覺信息。

1.5個體數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)處理在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院數(shù)字化影像技術(shù)實驗室完成，采用功能性神經(jīng)影像分析(Analysis of Functional NeuroImages, AFNI)軟件進行處理。首先去除原始功能像前4個時間點以消除掃描之初不穩(wěn)定因素的影響，將剩余時間點的數(shù)據(jù)與第一個時間點對齊，然后用半高全寬(full width half maximum, FWHM)為6 mm的高斯函數(shù)對數(shù)據(jù)進行濾波，以減少空間噪聲的影響；利用AFNI軟件的內(nèi)置程序(3Dvolreg)得到每一個數(shù)據(jù)的頭動參數(shù)，剔除頭動超過2 mm或旋轉(zhuǎn)超過2°的數(shù)據(jù)；利用3dDetrend消除數(shù)據(jù)的低頻噪聲和信號漂移，最后利用3dDeconvolve計算個體統(tǒng)計參數(shù)圖，從中提取coef值并將統(tǒng)計參數(shù)圖轉(zhuǎn)換到標(biāo)準(zhǔn)的Talairach空間。

1.6組內(nèi)分析及組內(nèi)不同輪次比較首先采用FWHM為5 mm的高斯函數(shù)對個體數(shù)據(jù)進行濾波，然后應(yīng)用AFNI的組分析程序(3dttest++)對兩組個體數(shù)據(jù)進行組內(nèi)分析及組內(nèi)不同輪次比較，為了消除性別、年齡及針刺感覺對實驗結(jié)果的影響，分別將每一個體的性別、年齡及雙側(cè)針刺感覺(酸、麻、重、脹、行走感、疼痛；無=0，有=1)作為協(xié)變量，然后進行Monte Carlo閾值校正，P=0.01，用3dClustSim程序算出α≤0.05的最小數(shù)據(jù)簇大小。采用單樣本t檢驗對兩組各3輪功能像掃描數(shù)據(jù)進行組內(nèi)分析，采用配對樣本t檢驗對每一組間3輪掃描(R2vsR1，R3vsR2，R3vsR1)進行組內(nèi)不同輪次比較，顯示激活區(qū)，統(tǒng)計并記錄激活區(qū)的位置。

2結(jié)果

2.1病例剔除情況刺激方案組有2例頭部移動超過標(biāo)準(zhǔn)，未納入統(tǒng)計結(jié)果，剩余18例(男7例，女11例，平均年齡24.5歲)滿足實驗要求；持續(xù)時間組也有2例頭部移動超過標(biāo)準(zhǔn)，剩余18例(男6例，女12例，平均年齡23.0歲)滿足實驗要求，納入最終的實驗結(jié)果。

2.2組內(nèi)fMRI信號比較組內(nèi)分析結(jié)果顯示，大腦對每一組各3輪刺激的反應(yīng)是不同的。在R1，兩組均觀察到fMRI信號增高腦區(qū)；在R2，兩組觀察到fMRI信號減低腦區(qū)；在R3，持續(xù)時間組顯示廣泛的信號增高腦區(qū)，而刺激方案組顯示廣泛的fMRI信號減低腦區(qū)。見表1、圖2。

2.3組內(nèi)不同輪次fMRI信號比較持續(xù)時間組和刺激方案組每組內(nèi)3輪之間fMRI信號兩兩比較，均存在差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的腦區(qū)。刺激方案組R3與R1、R3與R2相比存在fMRI信號減低腦區(qū)；持續(xù)時間組R2與R1相比存在fMRI信號減低腦區(qū)，與刺激方案組不同的是，持續(xù)時間組R3與R1相比存在fMRI信號增強腦區(qū)。見表2、圖3。

3討論

大量的文獻報道了針刺可以引起特定腦區(qū)及腦功能網(wǎng)絡(luò)的激活，并且研究了不同的影響因素對針刺fMRI結(jié)果的影響。本研究關(guān)注針刺刺激本身，即針刺持續(xù)時間及針刺刺激方案對針刺fMRI腦功能激活區(qū)定位的影響。

表1　持續(xù)時間組和刺激方案組組內(nèi)fMRI信號比較

注：P=0.01，α≤0.05，簇數(shù)=20，Z值>0代表信號增高區(qū)域，Z值<0代表信號減低區(qū)域；BA為布魯?shù)侣謪^(qū)(Brodmann area)，括號中數(shù)字表示布魯?shù)侣謪^(qū)中激活腦區(qū)的位置。

3.1針刺持續(xù)時間對腦功能激活區(qū)定位的影響針刺累積效應(yīng)，也稱作針刺的后效應(yīng)、持續(xù)效應(yīng)或延遲效應(yīng)，已經(jīng)被許多文獻[5，8-10]所報道。基于典型組塊設(shè)計和一般線性分析模型的腦功能激活區(qū)，可能會受到針刺累積效應(yīng)的影響[11]?；谕瑯拥慕M塊設(shè)計、掃描參數(shù)及數(shù)據(jù)處理方法，持續(xù)時間組組內(nèi)分析結(jié)果顯示3輪fMRI信號均是不同的，而且3輪fMRI信號之間兩兩比較均存在差異性腦區(qū)，但是第2輪掃描和第1輪掃描相比存在信號減低區(qū)域。本研究結(jié)果和國外Yeo等[12]的研究結(jié)果相似，在他們的研究中，也是采用了相同的刺激方案連續(xù)采集了兩次功能像數(shù)據(jù)，第2次掃描也顯示信號減低區(qū)域。與之不同的是本組掃描時間足夠長，并且在3輪功能像之間分別掃描了2D和3D解剖數(shù)據(jù)?？紤]到短時程的刺激不能完全模擬臨床長時間針刺產(chǎn)生的效應(yīng)[13]，本研究采用了足夠長的時間證明是否存在針刺持續(xù)效應(yīng)。組內(nèi)分析結(jié)果顯示第3輪刺激顯示了更多激活的腦區(qū)，并且和第1輪、第2輪掃描結(jié)果相比出現(xiàn)更多的信號增高腦區(qū)。這些結(jié)果提示，即便采用相同的針刺刺激模式，采用同樣的數(shù)據(jù)處理方法進行后處理，不同的針刺持續(xù)時間也會影響大腦對針刺的反應(yīng)。綜上所述，在針刺腦功能成像的研究方面應(yīng)該考慮到針刺的持續(xù)時間及時間變異性對研究結(jié)果的影響。

3.2針刺刺激方案對腦功能激活區(qū)定位的影響為了證明大腦對針刺的反應(yīng)到底受到哪些因素的影響，許多學(xué)者做了大量的研究，但是針刺刺激方案作為針刺腦功能成像實驗設(shè)計的重要環(huán)節(jié)之一，尚未得到足夠的重視[7]。在針刺腦功能成像的研究中，最常用的針刺刺激方案包括典型組塊設(shè)計、改良組塊設(shè)計和事件相關(guān)設(shè)計。在典型組塊設(shè)計中，一個序列是由若干個具有等間距的刺激和靜息組塊組成的，但其缺點在于刺激比較規(guī)則，被試者可能因此產(chǎn)生期望效應(yīng)和習(xí)慣化效應(yīng)[14]等，因此無法完全模擬臨床針灸的實踐操作。在改良組塊設(shè)計中，是由許多不等間距的組塊所組成，但其缺點同樣在于規(guī)律相對比較規(guī)則。Qin等[15]提出的非重復(fù)事件相關(guān)設(shè)計，也就是單組塊后長時間靜息的刺激模式，這種模式因太過簡單而無法適應(yīng)臨床及實驗的需要?？傊?，在臨床中用到的針刺刺激方案和針刺腦功能實驗中用到的方案相比更加不規(guī)則及隨機化，因此本研究設(shè)計了一個由若干刺激和靜息時間均不等的不規(guī)則組塊組成的事件相關(guān)設(shè)計。

首先，從組內(nèi)分析結(jié)果可以看出，刺激方案組的第3輪刺激顯示廣泛的信號減低腦區(qū)，而持續(xù)時間組的第3輪刺激顯示的是廣泛的信號增高腦區(qū)；其次，刺激方案組的組內(nèi)不同輪次fMRI信號比較結(jié)果顯示激活強度是按照掃描方案的順序逐漸減弱的，但持續(xù)時間組與之相反。通過分析刺激方案組第3輪掃描的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些激活的腦區(qū)與大多數(shù)文獻報道的針刺激活腦區(qū)基本一致，包括島葉、第二軀體感覺區(qū)(SⅡ)、中扣帶回和小腦等一些體感區(qū)，但本研究中這些區(qū)域均是信號減低區(qū)域而不是文獻報道的信號增高區(qū)域[16]。這些結(jié)果提示不同的針刺刺激方案均會影響大腦對針刺的反應(yīng)，盡管尚不能確定事件相關(guān)設(shè)計必然優(yōu)于組塊設(shè)計，但至少可以說明不同的刺激模式會影響針刺腦功能激活區(qū)的定位，在以后的針刺腦功能成像的研究中必須考慮針刺刺激方案的影響。

3.3不足與總結(jié)本研究利用BOLD-fMRI技術(shù)，初步證實針刺持續(xù)時間及針刺刺激方案都會對腦功能成像的激活區(qū)定位產(chǎn)生影響，但本研究仍然存在一些不足之處。首先，在持續(xù)時間組，為了證明每一輪掃描激活區(qū)的不同是由針刺的累積效應(yīng)引起的，最好增加常規(guī)任務(wù)作為對照組，如手指運動或視覺刺激，這些任務(wù)理論上與針刺得到的結(jié)果類似。其次，盡管在數(shù)據(jù)處理過程中考慮到針刺的感覺，并將之作為協(xié)變量加以去除，但也不能完全保證這種差異不是由針刺的感覺所導(dǎo)致的，因為最后統(tǒng)計的針刺感覺只是受試者在整體實驗過程中的針刺感覺，而針刺的感覺在實驗的過程中是動態(tài)變化的[17]。最后，有學(xué)者[18]報道了一般線性分析方法不太適合檢測針刺引起的神經(jīng)生理反應(yīng)，而本研究結(jié)果也有可能受到方法學(xué)的影響，在以后的研究中宜應(yīng)用新的數(shù)據(jù)分析方法以減少方法學(xué)對實驗結(jié)果的影響。

圖2　持續(xù)時間組和刺激方案組組內(nèi)fMRI信號比較

組 別組內(nèi)輪次比較激活腦區(qū)(BA)偏側(cè)Z峰值Talairach坐標(biāo)X峰值Y峰值Z峰值體素持續(xù)時間R2vsR1顳中回(39)左-4.2537.561.526.535楔前葉(7)左-3.544.546.547.526R3vsR1小腦第Ⅶa小葉右3.85-25.576.5-36.5101小腦第Ⅸ小葉右3.97-13.552.5-51.586小腦第Ⅶa小葉左3.8928.567.5-27.549腦干左3.977.522.5-42.541小腦第Ⅶa小葉左3.7213.579.5-27.539前扣帶回(32)右3.85-1.5-43.58.538額中回(6)右3.96-28.5-7.556.533小腦山頂右3.64-13.528.5-18.522R3vsR2小腦第Ⅶa小葉右4.11-40.546.5-33.5238額下回(47)左3.8837.5-25.5-12.565顳中回(21)右4.23-49.5-1.5-21.554顳中回(37)右3.85-55.546.5-3.554額中回(10)左3.7637.5-52.511.543小腦第Ⅷb小葉右3.12-7.540.5-45.539額中回(46)右4.11-46.5-19.526.532枕中回(18)右3.98-28.582.5-9.530顳中回(22)右3.78-64.540.52.524額下回(44)右3.27-52.5-7.523.522額中回(8)左3.3025.5-22.541.521前扣帶回(25)左3.364.51.5-3.520額中回(9)右3.82-22.5-37.535.520刺激方案R2vsR1小腦第Ⅷa小葉右-4.04-10.570.5-33.533小腦山頂左-3.6722.531.5-27.529顳下回(20)左-3.3352.525.5-21.526小腦第Ⅵ小葉右-3.25-10.558.5-3.525R3vsR1中央旁小葉(31)左-4.384.519.544.5188顳上回(22)左-4.3061.57.52.5139小腦第Ⅶb小葉右-4.10-10.567.5-24.582額中回(6)右-3.80-28.54.559.545額下回(47)右-3.73-52.5-19.5-3.542羅蘭迪克島蓋(41)右-3.49-43.525.514.540楔前葉(7)右-3.86-1.558.559.540小腦第Ⅵ小葉右-3.29-19.558.5-15.528顳中回(21)左-3.6858.519.5-12.521R3vsR2中央旁小葉(6)右-4.10-7.519.553.550島葉(13)右-4.37-40.57.5-3.540舌回(19)右3.9919.561.55.532后扣帶回(30)右3.56-7.567.511.531小腦第Ⅵ小葉左3.5634.552.5-24.528

注：P=0.01，α≤0.05，簇數(shù)=20，Z值>0代表信號增高區(qū)域，Z值<0代表信號減低區(qū)域；BA為布魯?shù)侣謪^(qū)(Brodmann area)，括號中數(shù)字表示布魯?shù)侣謪^(qū)中激活腦區(qū)的位置。

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Influence of Duration and Stimulation Protocol of Acupuncture on Brain Functional Imaging

ZHANGWei1,XUChun-sheng1,LIChuan-fu1,LIUJun-ping1,WUHong-li2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.InstituteofMedicalInformationEngineering,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the influence of duration and stimulation protocol of acupuncture on localization of the active region in brain functional imaging with other influencing factors remaining the same using blood oxygenation level dependent-functional magnetic resonance imaging (BOLD-fMRI). MethodsA total of 40 healthy volunteers were enrolled and equally divided into duration group and stimulation protocol group. The duration group received three runs (R1, R2, and R3) of collection of functional imaging data with the same stimulation protocol (modified block design), and the stimulation protocol group received three runs of collection of functional imaging data with different stimulation protocols (typical block design, modified block design, and event-related design). The same MR scanning parameters were applied for the two groups. AFNI software was used for data analysis, and the Monte Carlo threshold correction method was used to determine the active region of brain function and to obtain the results of intra-group analysis and comparison between different runs within each group. ResultsThe fMRI signal showed significant differences within the duration group or the stimulation protocol group. There were brain regions where fMRI signal was significantly different across these runs. In both groups, there were brain regions where fMRI signal decreased from R1 to R2. There were extensive brain regions where fMRI signal decreased from R1 to R3 in the stimulation protocol group, while there were brain regions where fMRI signal increased from R1 to R3 in the duration group. ConclusionDuration and stimulation protocol of acupuncture influence the localization of active regions in bran functional imaging.

[Key words]Functional magnetic resonance imaging; Brain; Acupuncture; Stimulation protocol; Duration

基金項目：國家“973”計劃項目(2010CB530505)；安徽省教育廳重大科研項目(KJ2011ZD05)

作者簡介：張威(1986-)，男，住院醫(yī)師

通信作者：李傳富，lcf_1966@126.com

[中圖分類號]R245；R445.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.020

(收稿日期：2016-01-12；編輯：姚實林)