方海雁，劉　蕾，施　慧，黃金玲，洪星輝

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科技處，安徽 合肥　230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥　230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥　230038)

化痰通瘀解毒方提取物對人胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

方海雁1，劉蕾2，施慧2，黃金玲3，洪星輝3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科技處，安徽 合肥230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]目的觀察化痰通瘀解毒方提取物對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法10、20、40 μg/mL化痰通瘀解毒方提取物分別干預(yù)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 24 h后，采用Transwell小室法檢測人胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲、遷移能力，分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和Western blot法檢測SGC-7901細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)水平。結(jié)果4組SGC-7901的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)以及E-cadherin和MMP-9表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，以高劑量化痰解毒方提取物的效應(yīng)最明顯。結(jié)論化痰解毒方可抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲和遷移能力，其作用機(jī)制可能與上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]化痰通瘀解毒方；胃癌細(xì)胞；SGC-7901；侵襲；轉(zhuǎn)移；E-鈣黏蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶9

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均居于惡性腫瘤的第3位[1]。胃癌細(xì)胞的浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌進(jìn)展及術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因[2]。既往研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，化痰通瘀解毒方(Huatan-Tongyu-Jiedu Decoction，HTJD)能有效抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和移植瘤小鼠微血管的生成。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，擬觀察HTJD提取物對人胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1材料

1.1藥物HTJD(半夏、瓜蔞、黃連、白花蛇舌草、酒大黃、三七、壁虎、薏苡仁、茯苓、人參等)所有中藥飲片均購自安徽濟(jì)仁藥業(yè)有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定。采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選HTJD的最佳水提工藝，即加10倍量水，提取3次，每次45 min，合并濾液，減壓濃縮，得HTJD水提物。取HTJD水提物適量，75%乙醇醇沉，靜置過夜，取上清液，沉淀物用75%乙醇洗凈，與之合并，減壓濃縮，移放冷處，靜置一定時(shí)間，待沉淀完全，濾過，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫蒸發(fā)，得干燥粉末。稱取HTJD提取物干燥粉末，用DMEM培養(yǎng)液溶解、稀釋，配制所需濃度藥液，調(diào)整酸堿度至pH 7.4，微孔濾膜(0.22 μm)濾過，分裝，4 ℃保存?zhèn)溆?。測定藥物干預(yù)最大濃度(40 μg/mL)，懸液滲透壓為304 mOsmol/kg。

1.2細(xì)胞人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

1.3試劑Transwell小室：孔徑8.0 μm, 美國Millipore公司；Matrigel膠：美國BD公司；基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9， MMP-9)ELISA檢測試劑盒：上海生工生物工程有限公司；兔抗人E-cadhein抗體：英國Abcam公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液：美國HyClone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)：浙江省杭州四季青公司；HRP結(jié)合的IgG二抗：美國Bioworld公司。

1.4設(shè)備Forma 370細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；純水-超純水凈化器：美國millipore公司；PowerPac系列電泳儀：美國Bio-Rad公司；FCM凝膠成像儀：美國protein simple公司；Olympus IX51倒置熒光顯微鏡：日本Olympus公司；ATOM酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)：意大利Maroche公司；Centrifuge 5430R超低速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；人工基底膜Matrigel膠：美國BD公司。

2方法

2.1Transwell小室檢測HTJD提取物對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響無血清培養(yǎng)液稀釋Matrigel膠至5 mg/mL，取100 μL稀釋膠加至帶有8 μm孔徑聚碳酸酯膜的Transwell小室內(nèi)，37 ℃孵育1 h。取對數(shù)生長期細(xì)胞SGC-7901，分別加入10、20、40 μg/mL HTJD提取物作用24 h，胰酶消化處理，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106/mL，各組吸取200 μL接種于Transwell小室內(nèi)，同時(shí)下室加入600 μL含10% FBS完全培養(yǎng)液。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，棄上室余液，PBS清洗3次，用棉簽擦去上室未侵襲細(xì)胞和Matrigel膠，取下微孔濾膜，用0.1%結(jié)晶紫細(xì)胞染色。在倒置熒光顯微鏡(10×20倍)下觀察，每組隨機(jī)選取5個(gè)不同視野的穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞侵襲抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)/對照組穿膜細(xì)胞數(shù))×100%。

2.2Transwell小室檢測HTJD對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響采用“2.1”項(xiàng)下Transwell小室法，省略在8.0 μm孔徑聚碳酸酯膜鋪Matrigel膠步驟，其余實(shí)驗(yàn)步驟與“2.1”相同。細(xì)胞遷移抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)/對照組穿膜細(xì)胞數(shù))×100%。

2.3Western blot檢測人胃癌細(xì)胞SGC-7901 E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)水平取對數(shù)生長期細(xì)胞SGC-7901，接種于6孔板中，分別加入含不同濃度(0、10、20、40 μg/mL)HTJD提取物培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg總蛋白上樣于10% SDS-PAGE中電泳，分離蛋白質(zhì)，槽式濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜，加入1∶1 000稀釋的E-cadherin一抗，4 ℃孵育12 h，加入合適稀釋度的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST搖洗3次，每次5 min。曝光后，采用Image J軟件進(jìn)行分析。

2.4ELISA檢測人胃癌細(xì)胞SGC-7901中MMP-9表達(dá)水平取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，接種至24孔板中，分別加入含不同濃度(0、10、20、40 μg/mL)的HTJD提取物培養(yǎng)液，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在480 nm處測量各孔OD值。

3結(jié)果

3.1HTJD提取物對人胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲能力和遷移能力的影響 4組穿膜侵入Transwell下室的SGC-7901細(xì)胞數(shù)量和穿過8.0 μm孔徑聚碳酸酯膜遷移至Transwell下室的細(xì)胞數(shù)量比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(侵襲細(xì)胞數(shù)：F(3，8)=81.57，P=0.000；遷移細(xì)胞數(shù)：F(3，8)=596.46，P=0.000)。隨著劑量增加，HTJD提取物對SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力的抑制作用越強(qiáng)，具有明顯的劑量依賴性。結(jié)果見表1和圖1。

表1　HTJD提取物對人胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與HTJD提取物10 μg/mL組比較，#P<0.05；與HTJD提取物20 μg/mL組比較，△P<0.05。

注：A.空白對照組；B. HTJD提取物10 μg/mL組；C. HTJD提取物20 μg/mL組；D. HTJD提取物40 μg/mL組；圖中白色箭頭示SGC-7901細(xì)胞，黑色箭頭示8.0 μm聚碳酸酯膜孔徑。

圖1HTJD提取物對胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲能力的影響(倒置顯微鏡下觀察，結(jié)晶紫染色，10×20倍)

3.2HTJD提取物對胃癌SGC-7901細(xì)胞中E-cadherin和MMP-9表達(dá)水平的影響4組E-cadherin和MMP-9表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(E-cadherin：F(3，8)=39.83，P=0.000；MMP-9：F(3，8)=92.54，P=0.000)。隨著劑量增加，HTJD提取物促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901表達(dá)E-cadherin的作用和抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901表達(dá)MMP-9的作用越明顯，具有明顯的劑量依賴性。結(jié)果見圖2。

4討論

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特性之一，直接影響臨床療效和預(yù)后，也是危及患者生命的主要原因[5]。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是個(gè)復(fù)雜有序的過程，大致可分為脫落、黏附、降解基質(zhì)和移動4個(gè)過程，阻斷其中的任一環(huán)節(jié)，均有可能抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室法檢測HTJD提取物對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，結(jié)果顯示，

注:A為空白對照組;B、C、D分別為HTJD提取物10、20、40μg/mL組;與空白對照組比較,*P<0.05;與HTJD提取物10μg/mL組比較,#P<0.05;與HTJD提取物20μg/mL組比較,△P<0.05。

圖2HTJD提取物對胃癌SGC-7901細(xì)胞中E-cadherin和MMP-9表達(dá)水平的影響(n=3)

HTJD提取物各劑量(10、20、40 μg/mL)干預(yù)胃癌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的侵襲和遷移抑制率均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且抑制效應(yīng)呈劑量依賴關(guān)系。提示HTJD提取物可抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲和轉(zhuǎn)移，是其抗癌作用機(jī)制之一。

在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，許多細(xì)胞黏附分子和蛋白水解酶參與調(diào)控。E-cadherin是一種具有黏附特性的跨膜糖蛋白，廣泛存在于各類上皮細(xì)胞中，與其細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白——連環(huán)素形成復(fù)合體后，介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶。E-cadherin表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)使上皮細(xì)胞離散，癌細(xì)胞易于脫落，具有較強(qiáng)的侵襲能力，且E-cadherin蛋白的表達(dá)與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生也有密切的關(guān)系[6-7]。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的降解是浸潤和轉(zhuǎn)移的早期信號[8]，這一過程需要降解酶系的參與，其中MMPs是最重要的一類。MMPs是一類含Zn2+依賴性蛋白酶，其主要功能是降解ECM成分。黏附后的癌細(xì)胞通過自身分泌或誘導(dǎo)產(chǎn)生MMPs，局部降解ECM，腫瘤細(xì)胞沿著缺失的ECM向周圍組織浸潤，導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，主要功能是降解破壞ECM中最主要的組分Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠。有研究[9-10]證實(shí)，抑制MMP-9基因表達(dá)可在一定程度上達(dá)到抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的目的。

綜上，E-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá)高低與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，成為胃癌治療和降低轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的新的治療靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)借助Western blot和ELISA技術(shù)，對E-cadherin和MMP-9蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，觀察到HTJD提取物呈劑量依賴性地升高E-cadherin表達(dá)水平和降低MMP-9表達(dá)水平。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生乃外受邪毒，內(nèi)傷七情，臟腑失調(diào)，陰陽失衡，痰凝瘀阻毒蘊(yùn)而成。癌毒痰瘀膠結(jié)、深伏盤踞是其基本病機(jī)。因此，活血化瘀、化痰散結(jié)是腫瘤治療及防治復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要方法。HTJD由半夏、瓜蔞、黃連、白花蛇舌草、酒大黃、三七、壁虎、薏苡仁、茯苓、人參等組成，具辛開苦降、清熱滌痰、解毒開結(jié)、逐邪護(hù)正之功。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，該方提取物能有效抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲和轉(zhuǎn)移，且作用機(jī)制可能與下調(diào)MMP-9的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為HTJD的抗癌作用提供了新的研究方向，但進(jìn)一步的研究尚需結(jié)合體內(nèi)及臨床實(shí)驗(yàn)來明確其應(yīng)用前景。

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Effect of Extract of Huatan-Tongyu-Jiedu Decoction on Invasion and Migration of Human Gastric Carcinoma Cell Line SGC-7901

FANGHai-yan1,LIULei2,SHIHui2,HUANGJin-ling3,HONGXing-hui3

(1.DepartmentofScienceandTechnology,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.GraduateCollege,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 3.InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of extract of Huatan-Tongyu-Jiedu Decoction (HTJD) for dispelling phlegm, resolving stasis, and detoxicating on the invasion and migration of human gastric carcinoma cell line SGC-7901. MethodsHuman gastric carcinoma SGC-7901 cells were treated with 10, 20, or 40 μg/mL extract of HTJD for 24 h. The invasion and migration of SGC-7901 cells were evaluated by Transwell chamber assay. The expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and E-cadherin in SGC-7901 cells was determined by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot. ResultsThe four groups showed significant differences in the number of invading and migrating SGC-7901 cells, as well as in the expression of E-cadherin and MMP-9 (all P<0.05). HTJD extract had a dose-dependent effect on the invasion and migration of SGC-7901 cells, greatest at the highest dose. ConclusionHTJD can inhibit the invasion and migration of human gastric carcinoma SGC-7901 cells, and the mechanism may be related to the up-regulation of E-cadherin expression and down-regulation of MMP-9 expression.

[Key words]Huatan-Tongyu-Jiedu Decoction; Gastric carcinoma cell; SGC-7901; Invasion; Migration; E-cadherin; Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173171，81573864)；安徽高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A393)

作者簡介：方海雁(1984-)，女，碩士，講師

通信作者：黃金玲，jinling6181@126.com

[中圖分類號]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.022

(收稿日期：2016-03-05；編輯：姚實(shí)林)