鄭立浪,陳月圓,盧鳳來(lái),李典鵬**

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林　541004；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所,廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林　541006)

尾巨桉化感作用對(duì)廣金錢草化學(xué)成分的影響*

鄭立浪1,2,陳月圓2,盧鳳來(lái)2,李典鵬2**

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所,廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541006)

摘要:【目的】研究尾巨桉Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis對(duì)廣金錢草Desmodium styracifolium(Osb.) Merr.藥材化學(xué)成分的影響，探索尾巨桉-廣金錢草復(fù)合經(jīng)營(yíng)模式的可行性?！痉椒ā吭谠囼?yàn)田中,以不同類型和重量的尾巨桉落葉鋪蓋在土壤上并種植廣金錢草,同時(shí)另在尾巨桉人工林中直接套種廣金錢草，待藥材成熟后統(tǒng)計(jì)其產(chǎn)量，并利用HPLC指紋圖譜法及含量測(cè)定法檢測(cè)其化學(xué)成分變化。【結(jié)果】廣金錢草在尾巨桉林下種植時(shí),產(chǎn)量稍有下降，但藥材指紋圖譜與正常種植無(wú)顯著差異?！窘Y(jié)論】廣金錢草可以套種在尾巨桉人工林下。

關(guān)鍵詞：尾巨桉廣金錢草化學(xué)成分HPLC

0引言

【研究意義】尾巨桉(Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis)[1]具有生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量高和木材品質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)[2]，是近年我國(guó)南方地區(qū)大力度推廣種植的速生桉良種之一，大范圍種植于廣東、廣西、海南等地[3]。目前，桉樹人工林快速發(fā)展，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)利益，但是其對(duì)環(huán)境的影響也越來(lái)越受到關(guān)注[4]。種植大面積桉樹林可能會(huì)嚴(yán)重降低土壤中的水分、生物多樣性和N、P、K等礦質(zhì)元素養(yǎng)分。通過開展桉樹人工林復(fù)合經(jīng)營(yíng)模式的研究，以解決大面積種植桉樹純林的負(fù)面效應(yīng)，一直是桉樹人工林科學(xué)發(fā)展的重要課題[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】廣金錢草Desmodium styracifolium (Osb. ) Merr.具有清熱除濕，利尿通淋的功效，用于治療各種熱病，水腫等疾病。該藥材在廣西不同地區(qū)均有規(guī)?；N植[6]。目前已有桉樹-藥材復(fù)合等經(jīng)營(yíng)模式的研究工作?；凶饔檬侵参锘蛭⑸锏拇x分泌物對(duì)環(huán)境中其它植物或微生物產(chǎn)生的有利或不利的作用。桉樹的化感作用會(huì)抑制其林下生物的生長(zhǎng)[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在桉樹林地內(nèi)套種廣金錢草，對(duì)其生長(zhǎng)、藥效基礎(chǔ)物質(zhì)(次生代謝產(chǎn)物的改變)的影響，目前未見有相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過在試驗(yàn)田中,以不同類型和重量的尾巨桉葉子鋪蓋其土壤之上種植廣金錢草,和在尾巨桉人工林中直接套種廣金錢草的方式,比較藥材的產(chǎn)量,及HPLC指紋圖譜法檢測(cè)主要化學(xué)成分的影響，為桉樹-廣金錢草復(fù)合經(jīng)營(yíng)模式提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，中藥粉碎機(jī)，R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi)，KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試劑

水(娃哈哈純凈水)，乙腈(美國(guó)fisher公司)，三氟乙酸(上海源葉科技)，甲醇(西隴化工)，夏佛塔苷標(biāo)準(zhǔn)品(成都瑞芬思生物科技有限公司)。

1.3材料

前期化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，尾巨桉的不同葉子，即綠葉、黃葉、灰葉的化學(xué)成分有較明顯的差異。綠葉為直接從樹上采摘風(fēng)干，保持原有綠色；黃葉為掉落不久的桉樹葉，為金黃色；灰葉為從林地收集的桉樹枯落葉，為灰色。于廣西黃冕林場(chǎng)同一林地內(nèi)采集3種葉子，并室內(nèi)陰干以備用。廣金錢草幼苗由當(dāng)?shù)剞r(nóng)民提供，另外從市場(chǎng)上購(gòu)買10個(gè)批次的合格廣金錢草藥材(編號(hào)為1～10)，作為對(duì)照用。所有材料經(jīng)過廣西植物研究所分類室韋發(fā)南研究員鑒定。

1.4方法

1.4.1不同種植條件對(duì)廣金錢草生長(zhǎng)的影響

分別在廣金錢草種植地上鋪尾巨桉葉(試驗(yàn)1),及在尾巨桉林地內(nèi)種植廣金錢草(試驗(yàn)2)。開展試驗(yàn)1的試驗(yàn)田位于廣西桂林市雁山區(qū)廣西植物研究所平地，首先將試驗(yàn)地劃分為1 m×1 m的小塊，間隔40 cm，每個(gè)小塊等間距種植廣金錢草幼苗9株，并分別鋪灰葉、綠葉和黃葉，每種葉子設(shè)置800 g/m2(尾巨桉人工林自然凋落量[8])和1 600 g/m2兩個(gè)濃度，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)2在廣西黃冕林場(chǎng)波寨分場(chǎng)進(jìn)行，所在地為坡地，桉樹為4年生二代林，平均株距1.5 m。將試驗(yàn)地內(nèi)所有雜草及灌木鏟除，松動(dòng)土壤，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每塊地面積為6.9 m×5.8 m。種植密度與試驗(yàn)1相同，均在6月份的陰雨天，選擇長(zhǎng)勢(shì)健壯，大小一致的幼苗進(jìn)行移栽,具體見表1。日常管理參考當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的管理方法。于10月初收割其所有地上部分，稱量鮮重后自然陰干并稱干重。

表1不同種植條件的樣品編號(hào)

Table1Sample of Desmodium styracifolium (Osb.)Merr.under different planting conditions

樣品編號(hào)SampleNo.種植條件Plantingcondition樣品編號(hào)SampleNo.種植條件Plantingcondition1～10市場(chǎng)上購(gòu)買Buyingonthemarket15大田,土表鋪尾巨桉綠葉1600g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisgreenleaves1600g/m211尾巨桉樹林下E.urophylla×E.grandisartificialforest16大田,土表鋪尾巨桉綠葉800g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisgreenleaves800g/m212大田,土表鋪尾巨桉葉0g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisleaves0g/m217大田,土表鋪尾巨桉黃葉1600g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisyellowleaves1600g/m213大田,土表鋪尾巨桉灰葉1600g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisgreyleaves1600g/m218大田,土表鋪尾巨桉黃葉800g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisyellowleaves800g/m214大田,土表鋪尾巨桉灰葉800g/m2Field,soilsurfacecoveredwithE.urophylla×E.grandisgreyleaves800g/m2

1.4.2HPLC法測(cè)定不同種植條件下廣金錢草的主要成分

供試品溶液的制備[8]：取廣金錢草陰干樣品(編號(hào)1～18)，稱取20 g，加500 mL水，超聲30 min，倒出，殘?jiān)?00 mL水，超聲30 min，合并兩次提取液用布氏漏斗和兩層濾紙抽濾，取100 mL濃縮至干，用50%(V/V)甲醇2 mL溶解，過0.45 μm濾膜，置于樣品瓶?jī)?nèi)備用。

色譜條件：色譜柱使用Poroshell 120 SB-AQ(4.6 mm×100 mm，2.7-micron)，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速0.7 mL/min，流動(dòng)相為A(乙腈)-B(水，含0.005 mol/L三氟乙酸)，采用梯度洗脫程序：0～10 min，5%～10% A；10～40 min，10%～15% A；40～50 min，15%～16% A；50～55 min，16%～100% A。

色譜儀精密度實(shí)驗(yàn)：取1號(hào)樣品，自動(dòng)進(jìn)樣器連續(xù)進(jìn)樣5次；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取1號(hào)樣品，分別在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h進(jìn)樣測(cè)定；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取1號(hào)樣品5份，自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)。

指紋圖譜的建立：取1～10號(hào)樣品進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定。樣品的 HPLC圖譜數(shù)據(jù)以AIA格式文件導(dǎo)出，將文件導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)2004A版“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，按多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法，生成對(duì)照?qǐng)D譜，導(dǎo)出對(duì)照?qǐng)D譜。取11～18號(hào)樣品,獲得HPLC圖譜數(shù)據(jù)的AIA文件并導(dǎo)入對(duì)照?qǐng)D譜(設(shè)置為參照譜)，選擇若干主要峰，手工多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，獲得相似度數(shù)據(jù)。

夏佛塔苷含量的測(cè)定：參照2015版《中國(guó)藥典》的方法[9]，使用液相色譜法，以夏佛塔苷標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，R=99.999%，依次測(cè)量各樣品的夏佛塔苷含量。

2結(jié)果和分析

2.1不同種植條件對(duì)廣金錢草產(chǎn)量的影響

以樣品12為對(duì)照(表2)，種植在尾巨桉人工林下的廣金錢草產(chǎn)量較低，為32%；樣品13～18，雖然其產(chǎn)量有稍微降低，但未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此可認(rèn)為在模擬試驗(yàn)中,尾巨桉葉子對(duì)廣金錢草的生長(zhǎng)未產(chǎn)生明顯影響。

2.2不同種植條件下廣金錢草HPLC指紋圖譜

色譜儀精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD和相對(duì)峰面積的RSD均小于5%，說(shuō)明儀器精密度良好，在96 h內(nèi)穩(wěn)定，獲得的指紋圖譜真實(shí)可靠，重復(fù)性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

表2不同種植條件下廣金錢草的產(chǎn)量

Table 2Yield of Desmodium styracifolium (Osb.)Merr.under different planting conditions

樣品編號(hào)SampleNo.地上部分鮮重Freshweightontheground(g/m2)地上部分干重Dryweightontheground(g/m2)地上部分干濕重比Dryandwetweightratioontheground(%)產(chǎn)量百分比Outputpercentage(%)1114924633132124675141530100133500128834911436251325349415450013503096163950131326931750001383289818400013732997

HPLC色譜圖顯示(圖1)，各樣品的色譜峰沒有顯著改變。通過相似度軟件計(jì)算分析得出(表3)，以樣品1～10為對(duì)照，樣品11～18的HPLC指紋圖譜相似度最低達(dá)到0.813，種植在尾巨桉人工林下的廣金錢草(樣品11)相似度達(dá)到了0.948，圖譜的主要峰都可以檢測(cè)得到，差異主要表現(xiàn)在含量上。

圖1廣金錢草各樣品HPLC指紋圖譜

Fig.1HPLC fingerprint of Desmodium styracifolium (Osb.)Merr.under different planting conditions

表3廣金錢草各樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度

Table 3The similarity of each sample to the control of Desmodium styracifolium (Osb.)Merr.

樣品Sample與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度Similaritytothereferencespectrum樣品Sample與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度Similaritytothereferencespectrum110.948150.958120.857160.813130.866170.868140.981180.867

2.3不同處理廣金錢草的夏佛塔苷含量

由表4可看出，各樣品的夏佛塔苷含量均達(dá)到了2015版《中國(guó)藥典》最低標(biāo)準(zhǔn)≥0.13%。種植在尾巨桉林下的廣金錢草(樣品11)夏佛塔苷含量與正常種植(樣品1～10)的含量較接近，實(shí)驗(yàn)田種植中大濃度尾巨桉葉處理的廣金錢草(樣品13,15,17)比低濃度組(樣品14,16,18)的夏佛塔苷含量略低。

表4廣金錢草各樣品夏佛塔苷含量

Table 4Content of schaftoside in each sample of Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.

樣品Sample含量Content(W/W,%)樣品Sample含量Content(W/W,%)10.22100.2120.29110.2430.15120.2140.21130.1750.29140.2860.27150.1470.19160.2180.42170.1890.28180.20

3討論

本文選用廣西規(guī)?；N植的廣金錢草與桉樹進(jìn)行套種，對(duì)比不同種植模式的廣金錢草HPLC指紋圖譜，探索廣金錢草藥材套種在桉樹林下的可行性。與廣金錢草套種桉樹類似的林草復(fù)合模式做為一種生態(tài)恢復(fù)方法,其作用已在長(zhǎng)江上游生態(tài)屏障的植被恢復(fù)中得到驗(yàn)證[10-11]。而在桉樹套種廣金錢草的過程中，本文著重檢驗(yàn)的是尾巨桉化感作用對(duì)廣金錢草化學(xué)成分的影響。

在各種植條件下，廣金錢草的主要化學(xué)成分沒有顯著改變，但是各成分的含量有一定的變化，這可能與化感作用的復(fù)雜性有關(guān)?；形镔|(zhì)的種類幾乎涵蓋所有植物化學(xué)物質(zhì)，目前研究的較多的是酚類和烯類。其作用機(jī)理也同樣復(fù)雜多樣，可在多個(gè)層次對(duì)植物產(chǎn)生影響，如影響細(xì)胞膜的通透性，植物激素的代謝，光合作用，酶活性等。

尾巨桉發(fā)揮化感作用的一個(gè)重要途徑是通過枯落物，而枯落物中大部分是凋落葉，有研究表明，尾巨桉凋落葉成分會(huì)隨時(shí)間變化發(fā)生變化。因此為了更好的控制條件，找出桉樹對(duì)廣金錢草可能的影響，本文除了在尾巨桉人工林下種植廣金錢草外，在試驗(yàn)田中使用不同時(shí)期的尾巨桉凋落葉處理廣金錢草，并且加大了濃度。對(duì)各種植條件下的廣金錢草,進(jìn)行的HPLC指紋圖譜研究表明,廣金錢草主要成分沒有發(fā)生大的改變。

雖然在林下種植的廣金錢草產(chǎn)量有所下降，但是廣金錢草種植時(shí)幾乎不需要管理，無(wú)其它投入，作為改善桉樹林下環(huán)境的補(bǔ)償措施是適合的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)廣金錢草種植當(dāng)年采收后，任其自然過冬及生長(zhǎng)，來(lái)年無(wú)須額外的管理，仍能收獲到與前一年相似的產(chǎn)量。在尾巨桉造林初期，林下光線尚充足時(shí)，廣金錢草的產(chǎn)量應(yīng)會(huì)有所增加，此時(shí)桉樹林裸露度大，廣金錢草對(duì)土壤生態(tài)化境的保護(hù)作用也更明顯。

試驗(yàn)中，廣金錢草幼苗成活后至收獲期靠自然降雨即可良好生長(zhǎng)，耐夏季烈日暴曬。各種植條件的光照強(qiáng)度為試驗(yàn)田最強(qiáng)，尾巨桉林次之，土壤濕度尾巨桉林最大，試驗(yàn)田最小，而廣金錢草的產(chǎn)量試驗(yàn)田最大，尾巨桉林次之，這也顯示廣金錢草的產(chǎn)量可能主要受光照影響，光照越足，產(chǎn)量越高。這間接表明在桉樹林地套種廣金錢草的主要約束條件是光照等，而非桉樹的化感物質(zhì)。

4結(jié)論

通過不同種植條件的廣金錢草產(chǎn)量及化學(xué)成分分析，廣金錢草在尾巨桉林下種植時(shí)產(chǎn)量稍有下降，但藥材指紋圖譜與正常種植無(wú)顯著差異，為桉樹-廣金錢草復(fù)合經(jīng)營(yíng)模式的生產(chǎn)提供了一定依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：竺利波)

Effect of Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis Allelopathy on Chemical Components of Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.

ZHENG Lilang1,2,CHEN Yueyuan2,LU Fenglai2,LI Dianpeng2

(1.Colleage of Life Sciences,Guangxi Normal University,Guilin,Guangxi,541004,China;2.Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization,Guangxi Institute of Botany,Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences Guilin,Guangxi,541006,China)

Abstract:【Objective】The chemical component variation of Desmodium styracifolium (Osb.) Merr. intercropping in Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis plantation was studied to explore the feasibility of E.urophylla×E.grandis and Desmodium styracifolium(Osb.) Merr. composite model.【Methods】Desmodium styracifolium (Osb.) Merr. was planted in a bare land with different weight of E.urophylla×E.grandis leaves covering on soils, which was also cultivated in E.urophylla×E.grandis plantation. The yield of Desmodium styracifolium (Osb.) Merr. was recorded after harvesting. Moreover,HPLC fingerprint method and determination of schaftoside were established to detect its chemical component variation.【Results】The yield of D.styracifolium (Osb.) Merr.cultivated in Eucalyptus forest decreased slightly,but its chemical fingerprints showed no obvious difference compared with the material which was normally cultivated.【Conclusion】D.styracifolium (Osb.) Merr.can interplant in Eucalyptus Plantations.

Key words:Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis，Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.，chemical component,HPLC

收稿日期：2015-10-18

作者簡(jiǎn)介：鄭立浪(1990-)，男，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

中圖分類號(hào)：R931.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-9164(2016)02-0184-05

修回日期：2016-01-29

*廣西重大專項(xiàng)項(xiàng)目(桂科重1347001)和廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1123014，2010GXNSFD169007)資助。

**通訊作者：李典鵬(1968-)，博士，研究員，主要從事中藥、天然藥物和植物化學(xué)研究，E-mail：ldp@gxib.cn。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(2):184～188

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-05-12

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160512.0944.014.html