三七重茬土壤中高效解磷菌的篩選和鑒定

龍賽波， 張曉東，王志遠(yuǎn)， 趙 靜*

(1.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南玉溪 653100；2. 德宏師范高等?？茖W(xué)校，云南芒市 678400)

三七重茬土壤中高效解磷菌的篩選和鑒定

龍賽波1， 張曉東1，王志遠(yuǎn)2， 趙 靜1*

(1.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南玉溪 653100；2. 德宏師范高等專科學(xué)校，云南芒市 678400)

摘要[目的]從三七重茬土壤中富集篩選解磷菌。[方法]分別于有機(jī)磷平板培養(yǎng)測定解磷圈大小，以Ca3(PO4)2為唯一磷源的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14 d，測定其溶磷量。[結(jié)果]從3株解磷菌中篩選到了1株具有較好解磷效果的菌株P(guān)9，菌株P(guān)9的菌落直徑最小，解磷圈直徑最大，接觸酶、淀粉水解、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)酸、肌醇產(chǎn)酸均為陽性，吲哚試驗呈陰性。[結(jié)論]生理生化試驗和16SrDNA測序表明，P9為歐文氏桿菌(Erwinia tasmaniensis)。

關(guān)鍵詞重茬土壤；解磷菌；歐文氏桿菌

土壤磷素循環(huán)是以微生物活動為中心，微生物的活動對土壤磷的轉(zhuǎn)化和有效性影響很大。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，微生物是控制和影響磷釋放的重要因素，可直接參與磷的循環(huán)[1]。解磷微生物(PhosphateSolubilizingMicroorganism,PSM)能夠?qū)⒂袡C(jī)磷分解為無機(jī)磷，把不溶性磷化合物轉(zhuǎn)化成可溶性磷[2]。目前，解磷微生物絕大多數(shù)是從土壤樣品中分離得到[3]。Kim等[4]報道了分離自植物根際土壤的1株解磷菌伯雷克氏菌MB14在沉積物除磷中的應(yīng)用，以防止湖泊或池塘富營養(yǎng)化的發(fā)生。重茬土壤中，由于植物對營養(yǎng)元素的偏好，使土壤營養(yǎng)元素呈現(xiàn)生理性不平衡現(xiàn)象，一些元素如Fe、Mn、B、Zn不斷減少，造成作物營養(yǎng)平衡失調(diào)，出現(xiàn)缺素癥狀。而隨著重茬年限的增加，土壤中氮、磷、鉀總量變化卻不大，原因可能是土壤中存在一定的解磷微生物。筆者擬從三七重茬土壤中分離高效解磷菌，測定其解磷能力，旨在為解除土壤中磷的富營養(yǎng)化提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1培養(yǎng)基的制備

1.1.1無機(jī)磷細(xì)菌固體培養(yǎng)基[5]。葡萄糖 10.00g，(NH4)2SO40.50g，NaCl0.50g，KC1 0.30g，MgSO4·7H2O0.30g，Ca3(PO4)210.00g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03g,MnSO4·4H2O0.03g。瓊脂粉18～20g/L，蒸餾水1L，pH7.0～7.5。

1.1.2有機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基[6]。葡萄糖10.00g， (NH4)2SO40.50g，NaCl0.30g，KCl0.03g，MgSO4·7H2O0.30g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，CaCO35.00g，(NH4)3PO40.50g。加蛋黃液10mL(蛋黃液由無菌生理鹽水與雞蛋1∶1配制)， 蒸餾水1L，pH為7.0～ 7.5。生理鹽水(9.00gNaCl溶于1L水中)。

1.2解磷菌的分離與篩選稱取5g三七重茬土壤，加入10mL水。取1mL與滅菌蒸餾水按1∶0、1∶1、1∶5的比例在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基中涂板，于37 ℃培養(yǎng)24h。挑選長勢較好的菌落在有機(jī)磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測量菌落和解磷圈的直徑。挑選出解磷效果較好的菌株接種于有機(jī)磷培養(yǎng)基中[7]。

1.3解磷能力的測定

1.3.1固體平板解磷能力[8]。將篩選的菌株點(diǎn)接于有機(jī)磷固體平板中培養(yǎng)，并測量菌落直徑和解磷圈直徑。

1.3.2液體培養(yǎng)基溶解Ca3(PO4)2能力。取菌株分別接入10mL無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，30 ℃下200～250r/min振蕩培養(yǎng)3d。取上述所得菌液2mL加入到100mL有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，30 ℃下200r/min振蕩培養(yǎng)14d。每天取1mL菌液于滅過菌的離心管中，4 ℃保存，待測。采用磷鉬藍(lán)比色法[8-9]測定解磷吸光光度值。

1.4菌株的鑒定

1.4.1生理生化試驗。參照文獻(xiàn)[10]對菌株P(guān)9進(jìn)行生理生化特征試驗。

1.4.216SrDNA基因片段序列測定。參照Weisburg等[11]的方法擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA片段。采用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1525R(5′-AAGGAGGTGWTCCARCC-3′)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 500bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化測序。

2結(jié)果與分析

2.1解磷細(xì)菌解磷圈直徑與菌落直徑通過無機(jī)磷培養(yǎng)，共分離得到12株解磷菌，采用平板法進(jìn)行初篩，根據(jù)解磷圈直徑和菌落直徑比值篩選到3株解磷效果較好的菌株(表1)。由表1可知，3個菌株中P9的菌落直徑最小，為2.0mm，但其溶磷圈直徑最大，達(dá)4.0mm。菌株P(guān)9相對于P10、P12，生長速度稍慢。從平板顯示法的估算難以全面鑒定出各解磷菌的解磷能力，需要通過液體發(fā)酵培養(yǎng)測定其溶解Ca3(PO4)2的能力，以進(jìn)一步分析其解磷能力。

表1解磷細(xì)菌解磷圈直徑與菌落直徑比較

Table1Comparisonofphosphate-solubilizingdiameterandcolonydiameter

菌株Strain菌落直徑Colonydiameter(d)∥mm解磷圈直徑Phosphate-solubilizingdiameter(D)∥mmD/dP92.04.02.000P105.53.00.545P126.03.00.500

2.2解磷細(xì)菌對Ca3(PO4)2的溶解能力從圖1可見，隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長，3株待測菌株上清液中水溶性磷含量均呈逐漸增加趨勢，其中菌株P(guān)9在第11天出現(xiàn)峰值，水溶性磷含量達(dá)248mg/L；菌株P(guān)10在第11天出現(xiàn)峰值，水溶性磷含量為170mg/L；菌株P(guān)12在第12天出現(xiàn)峰值，水溶性磷含量為217mg/L。出現(xiàn)峰值后，3個菌株待測液上清液中水溶性磷含量趨于平衡。

圖1　菌株P(guān)9、P10、P12的解磷曲線Fig.1　The phosphoate-solubilizing curve of strains P9, P10 and P12

2.3菌株的鑒定結(jié)果

2.3.1生理生化鑒定結(jié)果。對菌株P(guān)9進(jìn)行生理生化測定，結(jié)果表明，接觸酶、淀粉水解、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)酸、肌醇產(chǎn)酸均為陽性，吲哚試驗呈陰性(表2)。

表2菌株P(guān)9的生理生化鑒定結(jié)果

Table2TheresultsofphysiologicalandbiochemicalidentificationofstrainP9

序號SevialNo.指標(biāo)Index性質(zhì)Property1接觸酶Catalase+2淀粉水解Hydrolyzingstarch+3硝酸鹽還原Nitratereduction+4吲哚Idoltest-5葡萄糖產(chǎn)酸Acidproductionfromglucose+6肌醇產(chǎn)酸Acidproductionfrominositol+737℃生長Growthat37℃+

2.3.216SrDNA基因片段序列測定結(jié)果。為進(jìn)一步確認(rèn)所分離的菌株種屬類型，對P9進(jìn)行16SrDNA序列測定，測定結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，菌株P(guān)9與歐文氏桿菌(Erwinia tasmaniensis strain)(NR_074869.1)有99%的相似性。結(jié)合生理生化鑒定和16SrDNA結(jié)果可知，菌株P(guān)9屬于歐文氏桿菌。

圖2　菌株P(guān)9的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　16S rDNA phylogenetic tree of strain P9

3結(jié)論與討論

(1)該研究通過無機(jī)磷培養(yǎng)初篩，共分離到12株解磷菌。根據(jù)解磷圈直徑和菌落直徑比值篩選到3株解磷效果較好的菌株。其中，菌株P(guān)9的菌落直徑最小，但溶磷圈直徑最大，說明該菌株具有較強(qiáng)的解磷能力。對菌株P(guān)9進(jìn)行生理生化測定，結(jié)果表明，接觸酶、淀粉水解、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)酸、肌醇產(chǎn)酸均為陽性，吲哚試驗呈陰性。16SrDNA基因片段序列測定結(jié)果說明，菌株P(guān)9為歐文氏桿菌。

(2)目前，利用微生物肥料修復(fù)及緩解植物連作障礙已成為解決連作障礙的主要手段之一。解磷菌能夠提高土壤中有效磷含量，增加土壤肥力，促進(jìn)植物生長，在一定程度上能緩解作物連作障礙。至于該研究得到的菌株P(guān)9是否具有其他促生作用，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 李文紅,施積炎.西湖沉積物中解磷菌的分離純化及其解磷能力[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2006,17(11):2112-2116.

[2]ZAIDIA，KHANMS，AHEMADM.Plantgrowthpromotionbyphosphatesolubilizingbacteria[J].Actamicrobiologicaetimmunologicahungarica,2009,56(3):263-284.

[3]WANIPA,KHANMS,ZAIDIA.Co-inoculationofnitrogenfixingandphosphatesolubilizingbacteriatopromotegrowth,yieldandnutrientuptakeinchickpea[J].Actaagronomicacademiaescientiarumhungaricae,2007,55:315-323.

[4]KIMYH,BAEB,CHOUNGYK.Optimizationofbiologicalphosphorusremovalfromcontaminatedsedimentswithphosphatesolubilizingmicroorganisms[J].Journalofbioscienceandbioengineering,2005,99:23-29.

[5] 鐘小玉,于波,張晨光.盈江縣耕地土壤高效解磷菌的分離篩選研究[J].資源節(jié)約與環(huán)保，2013(8)：159-160.

[6] 郭樂,申元英.污水中解有機(jī)磷細(xì)菌的篩選及解磷能力測定[J].大理學(xué)院學(xué)報,2013(10)：50-53.

[7] 李素芹,張軍,王俊鳳,等.磷鉬藍(lán)光度法測定磷酸鈣中的磷含量[J].無機(jī)鹽工業(yè)，2008,40(3):55-56.

[8] 胡子全,趙海泉.一株有機(jī)解磷茵的篩選及其最佳生長條件的研究[J].中國給水排水，2007(17):66-70．

[9] 王亞藝,李松齡，蔡曉劍，等.青海解磷菌菌株的分離篩選[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,16(2):62-64.

[10] 方中達(dá).植病研究方法[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[11]WEISBURGWG,BARNSSM,PELLETIERDA,etal,16SribosomalDNAamplificationforphylogenticstudy[J].JournalofBacteriology,1991,173:697-703.

IsolationandIdentificationofPhosphate-solubilizingBacteriafromContinuousCroppingSoilofPanax notoginseng

LONGSai-bo1,ZHANGXiao-dong1,WANGZhi-yuan2,ZHAOJing1*

(1.ResourcesandEnvironmentCollege,YuxiNormolUniversity,Yuxi,Yunnan653100; 2.DehongTeacher’College,Mangshi,Yunnan678400)

Abstract[Objective] The aim was to isolate phosphate-solubilizing bacteria from continuous cropping soil of Panax notoginseng. [Method] The size of phosphate-solubilizing cycle was determined on plate using Ca3(PO4)2 as the sole source of inorganic phosphorus liquid in the running 14 days, and whose phosphate-solubilizing capacity was determined. [Result] From three isolated strains, one strain P9 having good phosphate-solubilizing effect was selected. The colony diameter of strain P9 was the smallest, and the diameter of phosphate dissolving circle was the largest. Contact enzyme, starch hydrolysis, nitrate reduction, glucose acid production, inositol acid production were positive, the indole test was negative. [Conclusion] Physiological, biochemical test and 16SrDNA sequencing indicates strain P9 belongs to Erwinia tasmaniensis.

Key wordsContinuous cropping soil; Phosphate-solubilizing bacteria; Erwinia tasmaniensis

基金項目云南省大學(xué)生創(chuàng)新項目(2011B15)；云南省教育廳研究基金項目(2013C140)。

作者簡介龍賽波(1991- )，女，云南保山人，本科生，專業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，講師，博士，從事植物病害生物防治研究。

收稿日期2016-03-21

中圖分類號S 154.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)12-082-02