小鼠口服五氯柳胺的急性毒性研究

張吉麗， 李 冰， 司鴻飛， 周緒正， 程富勝， 張繼瑜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050)

小鼠口服五氯柳胺的急性毒性研究

張吉麗， 李 冰， 司鴻飛， 周緒正， 程富勝， 張繼瑜*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050)

摘要[目的]為初步評(píng)價(jià)五氯柳胺的安全性，對(duì)其進(jìn)行小鼠的急性毒性試驗(yàn)。[方法]預(yù)試驗(yàn)采用遞增法確定給藥的劑量范圍和正式試驗(yàn)分組。正式試驗(yàn)采用簡(jiǎn)化寇氏法，灌胃給藥，觀察7 d，觀察給藥后小鼠的體征變化，統(tǒng)計(jì)死亡率和死亡時(shí)間，計(jì)算LD50值及其95%置信區(qū)間。[結(jié)果]小鼠口服五氯柳胺的LD50為1.130 g/kg，95%置信區(qū)間為0.940～1.359 g/kg。[結(jié)論]按照化學(xué)物的急性毒性劑量分級(jí)，五氯柳胺為低毒化學(xué)物。

關(guān)鍵詞五氯柳胺；小鼠；急性毒性試驗(yàn)；LD50

肝片吸蟲病是由肝片吸蟲引起的家畜常見的人畜共患病。該病遍及世界各地，嚴(yán)重阻礙了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)保障食品安全、公共衛(wèi)生安全和環(huán)境生態(tài)安全構(gòu)成了極大的威脅，同時(shí)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。抗肝片吸蟲類藥物是目前防治肝片吸蟲病最有效的手段。五氯柳胺(Oxyclozanide)是水楊酰苯胺類化學(xué)合成抗肝片吸蟲的藥物，主要用于治療牛和羊的肝片吸蟲感染，在抗絳蟲和線蟲等蠕蟲感染方面也有較好的治療效果。五氯柳胺通過阻礙蟲體線粒體的氧化磷酸化過程，使能量不能合成，蟲體因能量耗盡而死[1]。國(guó)外有學(xué)者報(bào)道五氯柳胺的臨床抗蟲效果顯著，明顯優(yōu)于阿苯達(dá)唑、萘托比胺、氯氰碘柳胺等藥物[2-3]。但是，國(guó)內(nèi)對(duì)五氯柳胺的系統(tǒng)性研究報(bào)道較少。為了初步評(píng)價(jià)五氯柳胺的安全性，筆者以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。SPF級(jí)昆明系小鼠80只，購自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，體重18～22 g，雌雄各半，雌性未產(chǎn)未孕。室溫下飼養(yǎng)3～5 d，自由采食飲水，以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。

1.1.2受試藥品。五氯柳胺原料藥，購自常州亞邦齊暉醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)為RD1506001。試驗(yàn)前，精密稱取五氯柳胺原料藥，以羧甲基纖維素鈉為助懸劑，配制0.2 g/mL的混懸劑，待用。

1.2方法

1.2.1預(yù)試驗(yàn)。采用遞加法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。將20只昆明系小鼠，體重為18～22 g，平均分為5組，每組4只，雌雄各半，分別給小鼠稱重，計(jì)算給藥劑量。最高劑量組給藥劑量為3.375 g/kg BW，最低劑量組給藥劑量為0.667 g/kg BW。試驗(yàn)前，禁食8～12 h，自由飲水。灌胃給藥，觀察7 d，記錄小鼠的死亡數(shù)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的最小致死劑量(LD100)和最大耐受劑量(LD0)來確定正式試驗(yàn)給藥劑量范圍、組數(shù)(N)以及各組間劑量比(r)。

1.2.2急性毒性試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得到的最小致死劑量(LD100)為3.375 g/kg，最大耐受劑量(LD0)為0.667 g/kg，采用簡(jiǎn)化寇氏法計(jì)算正式試驗(yàn)組數(shù)以及各組間劑量比。

五氯柳胺正式試驗(yàn)分為6組，包括5組不同劑量給藥組和1組空白對(duì)照組。將60只小鼠，隨機(jī)分為6組，5個(gè)給藥組的給藥劑量分別為3.375、2.250、1.500、1.000和0.667 g/kg。試驗(yàn)前，禁食8～12 h，自由飲水。根據(jù)體重計(jì)算給藥劑量?？瞻讓?duì)照組給予等量的飲用水。灌胃給藥后，前3 h持續(xù)觀察；3～8 h，每15 min觀察1次；8～12 h，每30 min觀察1次；12 h后，每2 h觀察1次；24 h后，每4 h觀察1次；3 d后，每天觀察3次，直至第7天結(jié)束。觀察小鼠的外觀體征、飲食、飲水、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)等，記錄小鼠死亡時(shí)間、死亡組別和死亡數(shù)量，對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢進(jìn)行切片處理，與空白對(duì)照組對(duì)比，觀察病理變化。采用改良寇氏法計(jì)算LD50及其95%置信區(qū)間。

LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]

(1)

(2)

LD50的95%置信區(qū)間= lg-1(lgLD50±1.96×SX50)

(3)

式中,Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)；i為組距，相鄰2組劑量對(duì)數(shù)值之差；p為各劑量組死亡率；q為各劑量組存活率；∑p為各劑量組死亡率之和；n為各組動(dòng)物數(shù)；SX50為lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2結(jié)果與分析

2.1預(yù)試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)五氯柳胺原料藥急性毒性預(yù)試驗(yàn)得到的最小致死劑量(LD100)為3.375 g/kg，最大耐受劑量(LD0)為0.667 g/kg。因此，確定正式試驗(yàn)的組數(shù)(N)為5，各組之間的劑量比值r為1.5。

2.2急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1臨床癥狀以及剖檢病理變化。據(jù)觀察，給藥后動(dòng)物表現(xiàn)出的癥狀如下：給藥后出現(xiàn)精神沉郁，伏臥不動(dòng)，眼睛微閉，被毛凌亂，食欲減退，給藥3 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡時(shí)間集中在3～12 h，死亡前出現(xiàn)全身震顫、側(cè)翻現(xiàn)象，大約持續(xù)5 min死亡。給藥36 h后，再無死亡現(xiàn)象，但高劑量存活小鼠依然表現(xiàn)為精神沉郁，3 d后逐漸恢復(fù)飲食、飲水。但是，將存活小鼠體重變化與空白組進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠體重增長(zhǎng)緩慢。第8天后，對(duì)全部小鼠進(jìn)行剖檢，與空白對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)給藥組肝有出血點(diǎn)、脾腫大、腎的質(zhì)地脆且易碎、胃壁薄而透明等現(xiàn)象，且高劑量組癥狀明顯。

2.2.2半數(shù)致死量(LD50)及95%置信區(qū)間。五氯柳胺混懸劑試驗(yàn)組的死亡數(shù)如表1所示。小鼠口服五氯柳胺的LD50為1.130 g/kg，95%的置信區(qū)間為0.940～1.359 g/kg。

表1　五氯柳胺原料藥正式試驗(yàn)結(jié)果

3討論

該試驗(yàn)選用SPF級(jí)昆明系小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身清潔無污染，有效消除試驗(yàn)誤差。在給藥過程中，嚴(yán)格按照灌胃給藥的操作，以防由于灌胃方法不當(dāng)而導(dǎo)致小鼠死亡，影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由于五氯柳胺不溶于水，所以在配制供試品過程中加入羧甲基纖維素鈉作為助懸劑，配制五氯柳胺供試品濃度為0.2 g/mL。但考慮到小鼠的胃容量，一般給藥量為每10 g體重的給藥量為0.1～0.2 mL[4]。因此，在給藥過程中，因?yàn)榻o藥體積過大，需要進(jìn)行多次給藥，2次給藥時(shí)間間隔1～2 h，給藥體積不得超過0.4 mL，防止小鼠因灌胃受試物的體積過大而撐死。

五氯柳胺作為一種高效抗肝片吸蟲化學(xué)合成藥物，臨床抗蟲效果顯著。但是，因其水溶性差，有一定的毒性，限制了其臨床應(yīng)用。研究開發(fā)一種或幾種五氯柳胺的上市制劑，對(duì)獸醫(yī)臨床防治肝片吸蟲病具有重要意義。該試驗(yàn)結(jié)果可為今后五氯柳胺新制劑的開發(fā)和臨床安全有效用藥提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉祥宜,朱建民,張建峰，等.五氯柳胺的合成[J].浙江化工，2010,41(8):11-12.

[2] SANABRIA R， MORENO L， ALVAREZ L，et al.Efficacy of oxyclozanide against adultParamphistomumleydeniin naturally infected sheep[J].Veterinary parasitology，2014,206:277-281.

[3] ARIAS M S,SANCHIS J,FRANCISCO I,et al.The efficacy of four anthelmintics againstCalicophorondaubneyiin naturally infected dairy cattle[J].Veterinary parasitology,2013,197:126-129.

[4] 農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心.獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2012:11.

Study on the Acute Toxicity of Oxyclozanide in Mice by Oral Administration

ZHANG Ji-li, LI Bing, SI Hong-fei, ZHANG Ji-yu*et al

(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS, Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development of Ministry of Agriculture, Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province, Lanzhou, Gansu 730050)

Abstract[Objective] In order to evaluate the safety of Oxyclozanide, the acute toxicity test in mice was conducted. [Method] The incremental method was used to determine the groups and dosage of the formal experiment in preliminary experiment. According to the simplified Karber's method in the formal experiment, after giving medicine lavage and observing for 7 days, the change of sign was observed after administration in mice, the mortality and death time was recorded, the LD50and 95% confidence interval was calculated. [Result] The LD50of Oxyclozanide in mice was 1.130 g/kg and 95% confidence interval was 0.940-1.359 g/kg. [Conclusion] According to the classification of acute toxicity dosages of chemicals, Oxyclozanide is the low toxic chemical.

Key wordsOxyclozanide; Mice; Acute toxicity test; LD50

基金項(xiàng)目“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD1101)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CAR-38)。

作者簡(jiǎn)介張吉麗(1992- )，女，黑龍江大慶人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物抗寄生蟲藥。*通訊作者，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。

收稿日期2016-03-13

中圖分類號(hào)S 865.1+3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)12-148-02