劉鏡文　陳莉　吳秋良

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細(xì)胞蠟塊宮頸液基細(xì)胞P16在檢測宮頸腫瘤中的作用

劉鏡文1陳莉2吳秋良3

［摘要］目的探討細(xì)胞蠟塊P16檢測在宮頸液基細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值。方法采用標(biāo)準(zhǔn)化病人（standardized patient，SP）免疫組織化學(xué)的方法對(duì)180例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行P16檢測。結(jié)果P16在未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）、未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASC?US）、不除外高度病變的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cells，cannot exclude a high?grade squamous intraepithelial lesion，ASC?H）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low?grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high?grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）和鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）中的陽性率分別為0%、5.63%、60.00%、30.23%、100.00%和100.00%。在180例患者中，只有73例有組織活檢的結(jié)果，其中P16陽性的為48例，宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）CINII級(jí)及以上病變患者為33例；P16陰性的有25例，無CINII級(jí)及以上病變。結(jié)論利用細(xì)胞蠟塊P16免疫組織化學(xué)染色，顯示P16的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，因此可用于宮頸癌的病變分級(jí)，也可作為輔助診斷指標(biāo)應(yīng)用于宮頸病變的篩查。

［關(guān)鍵詞］宮頸腫瘤；液基細(xì)胞學(xué)；免疫組織化學(xué)；細(xì)胞蠟塊；P16

作者單位：1.廣東省惠州市第一婦幼保健院病理科，廣東，惠州516000
2.廣東省東莞市虎門醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東，東莞523900
3.廣東省廣州市中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科，廣東，廣州510060

液基細(xì)胞學(xué)檢測相比較傳統(tǒng)的巴氏涂片法，具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、背景干凈的優(yōu)點(diǎn)，但由于人工閱片，受人為因素制約，同時(shí)常常存在不明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞等不明確的診斷，所以存在一定的假陽性和漏診率［1］。目前主張實(shí)行聯(lián)合篩查方案，即人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）檢測及液基細(xì)胞學(xué)檢測同時(shí)應(yīng)用進(jìn)行宮頸癌的篩查。HPV是引起宮頸癌和癌前病變的主要原因，HPV通過合成一系列致癌蛋白干擾正常的細(xì)胞調(diào)控，如致癌蛋白E7引起的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白PRb功能失活，破壞了PRb與腫瘤抑制因子P16之間的反饋環(huán)，使P16的特異性過度表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增生異常、遺傳變異和轉(zhuǎn)化。P16基因是繼P53之后后發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)抑癌基因，目前認(rèn)為P16的抑癌作用較P53更為直接［2］。該基因的失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞可無限制地?cái)U(kuò)增、生長，從而最終向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。國內(nèi)外大量研究表明：在正常宮頸組織中，P16蛋白表達(dá)為陰性，而在宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）CINI、CINII、CINIII、浸潤癌組均有表達(dá)，且隨著病變組織學(xué)分級(jí)的增加，陽性表達(dá)率及染色強(qiáng)度呈升高趨勢［3］。目前該基因大量應(yīng)用于宮頸活檢組織中，用于鑒別宮頸上皮病變及萎縮等良性病變。本研究結(jié)合細(xì)胞蠟塊的技術(shù)方法，旨在探討P16蛋白表達(dá)的指標(biāo)作為宮頸液基細(xì)胞學(xué)篩查輔助的可行性。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年11月至2014年11月期間在廣東省惠州市第一婦幼保健院門診就診的180例宮頸病變患者，用一次性標(biāo)本采集刷在宮頸口旋轉(zhuǎn)采集，將刷頭放入裝有10 mL固定保存液的小瓶中。經(jīng)TIB?AutoPrep1800沉降式全自動(dòng)液基薄層細(xì)胞制片染色系統(tǒng)程序化處理，制成直徑為1 cm的液集薄層細(xì)胞涂片。上述病變經(jīng)宮頸細(xì)胞學(xué)診斷為非典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells，ASC）及以上病變，或經(jīng)免疫細(xì)胞學(xué)診斷為鱗狀上皮內(nèi)病變（squamous intraepithelial lesion，SIL）及炎癥，均通過病理醫(yī)師采用美國Cytic公司的thingpath2000技術(shù)，巴氏染色，并按照2001年版Bethesda分級(jí)系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）診斷為標(biāo)準(zhǔn)確診。上述診斷結(jié)果由2位高年資病理醫(yī)師雙盲復(fù)診閱片，并做出一致的診斷。SIL指子宮內(nèi)皮在增生過程中出現(xiàn)的異常上皮細(xì)胞增長?；颊吣挲g為22歲～63歲，平均年齡為（40±4）歲。所有病例均無宮頸錐切和子宮切除史及其他慢性消耗性疾病。

1.2方法

1.2.1宮頸細(xì)胞學(xué)收集方法

采用Thinprep液集基細(xì)胞學(xué)檢測法（thinprep cytologic test，TCT），用專用細(xì)胞刷采集宮頸上皮細(xì)胞刷入TCT保存液，經(jīng)Thinprep2000系統(tǒng)，制成直徑為1 cm的薄層細(xì)胞學(xué)涂片，95%酒精固定，巴氏染色。

1.2.2細(xì)胞學(xué)診斷

用ThinPrep液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測系統(tǒng)來篩查宮頸病變，由細(xì)胞學(xué)專職人員閱片，采用TBS診斷分級(jí)系統(tǒng)（2001年修訂）［4］。

1.2.3 P16免疫組化檢測

先收集脫落細(xì)胞，利用離心沉淀、蛋白固定的方法，使細(xì)胞成塊，經(jīng)過脫水、包埋程序制作成片，用宮頸HELA細(xì)胞作為陽性對(duì)照，采用的P16抗體來自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)涂片染色進(jìn)行評(píng)估。光鏡下P16陽性物質(zhì)位于細(xì)胞核內(nèi)和（或）細(xì)胞質(zhì)中，以細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)染成粉色或棕黑色為陽性。根據(jù)異型細(xì)胞是否著色和著色細(xì)胞數(shù)來判斷P16蛋白的表達(dá)：1張涂片中至少5個(gè)異型細(xì)胞顯示胞核著色（不伴或伴有包漿著色）判讀為陽性；異型細(xì)胞主要表現(xiàn)在核漿比增大，胞核占整個(gè)細(xì)胞大小的一半以上；染色質(zhì)異常，胞核淡染或深染，染色質(zhì)分布不均成塊狀或顆粒狀；胞核形狀不規(guī)則，呈鋸齒狀或有較大凸起或凹陷；細(xì)胞聚集排列成條索狀、片狀，大小、形態(tài)不一。反之，著色的異型細(xì)胞數(shù)少于5個(gè)或沒有異型細(xì)胞著色判讀為陰性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1TBS分類結(jié)果

按TBS分類，可將所采集的180例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本分為6大類：未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）21例、未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypicalsquamous cell of undetermined significance，ASC?US）71例、不除外高度病變的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cells，cannot exclude a high?grade squamous intraepithelial lesion，ASC?H）5例、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low?grade squamous intraepi?thelial lesion，LSIL）43例、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high?grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）38例和鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）2例（圖1至圖4）。

2.2宮頸脫落細(xì)胞中P16的表達(dá)

免疫組化實(shí)驗(yàn)后光學(xué)顯微鏡下對(duì)涂片染色進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示在NILM、ASC?US、ASC?H、LSIL、HSIL和SCC中的陽性率分別為0、5.63%、60.00%、30.23%、100.00%和100.00%（表1）。P16 在HSIL中的陽性表達(dá)率達(dá)到100.00%，遠(yuǎn)大于其在LSIL中的陽性表達(dá)率30.23%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00 756〈0.01）。ASC?H的陽性率明顯高于ASC?US組（P=0.000 342〈0.01）。ASC和LSIL細(xì)胞著色明顯弱于HSIL，P16在LSIL中散在陽性，而在HSIL中彌漫表達(dá)，且在胞核和胞質(zhì)均著色，染色強(qiáng)度也隨著宮頸病變程度的加重而增強(qiáng)，表達(dá)強(qiáng)度與病變級(jí)別呈正相關(guān)。

表1　宮頸脫落細(xì)胞中P16的表達(dá)情況（n，%）Table 1 The expression of P16 in cervical cells（n，%）

2.3組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)標(biāo)本診斷的比較

在180例宮頸液基細(xì)胞學(xué)涂片中，只有73例有組織活檢的結(jié)果，其中液基細(xì)胞學(xué)涂片免疫組化染色P16蛋白陽性的為48例，其中33例組織學(xué)檢測結(jié)果為CINII級(jí)及以上病變；P16陰性的有25例，無CINII級(jí)及以上病變。

而這73例有組織活檢的結(jié)果中：液基細(xì)胞學(xué)診斷為ASC?US而組織學(xué)診斷為CINII級(jí)及以上病變的有8例，其中6例可見P16蛋白陽性染色的異型細(xì)胞；液基細(xì)胞學(xué)診斷為LSIL而組織學(xué)診斷為CINII級(jí)及以上病變的有13例，其中7例為非典型細(xì)胞P16蛋白陽性染色；液基細(xì)胞學(xué)診斷為ASC?H，而組織學(xué)診斷為CINII級(jí)及以上病變的有5例，其中3例可見P16蛋白陽性染色，余2例P16蛋白染色為陰性；細(xì)胞診斷為HSIL組織學(xué)診斷為CINII級(jí)及以上的病變5例，其中2例可見P16蛋白染色的異型細(xì)胞；液基細(xì)胞學(xué)診斷為SCC組織學(xué)診斷為CINII級(jí)及以上病變?yōu)?例，具體結(jié)果見表2。

表2　P16陽性病例的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)診斷對(duì)比Table 2 The comparison of detection on P16 in positive cases by cytology and histology

3　討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第2位，僅次于乳腺癌［5-6］。據(jù)世界范圍統(tǒng)計(jì)，每年估計(jì)有46.6萬的宮頸癌新發(fā)病例，其中80%發(fā)生在資源欠缺的發(fā)展中國家，其中亞洲占23.5萬，中國估計(jì)有近10萬新發(fā)病例，約占世界新發(fā)病例總數(shù)的1/5［7］。需要指出的是，每年新發(fā)的近50萬宮頸癌病例還只是冰山一角，據(jù)估計(jì)全球?qū)m頸癌高度癌前病變的婦女有1 000萬例，低度子宮頸病變的有3 000萬例［7］。我國大部分城市婦女由于缺乏有組織的篩查計(jì)劃和醫(yī)學(xué)知識(shí)，同樣也面臨著宮頸癌的嚴(yán)重威脅。特別是我國中西部農(nóng)村，由于缺乏資金和醫(yī)療技術(shù)，宮頸癌是婦女的主要衛(wèi)生問題之一。我國每年約有3萬名婦女死于宮頸癌［8］。目前我國花了大量的人力物力進(jìn)行宮頸癌的篩查，我們東莞市從2012年開始也由政府出巨資免費(fèi)為35歲～59歲的適齡婦女進(jìn)行宮頸癌和乳腺癌的篩查，但是，目前的篩查方案確診一個(gè)宮頸癌的患者需要做4個(gè)檢查，3次取材，確診周期較長，共需要檢查費(fèi)用1 000多元，因此探討宮頸癌篩查的更佳方案顯得尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，P16在CIN和宮頸癌中過量表達(dá)，更有實(shí)驗(yàn)證明隨著病變加重P16的表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化［8］。近年來關(guān)于多種癌抑制基因的研究表明，P16INK4A基因參加細(xì)胞周期調(diào)控，與腫瘤形成和發(fā)展直接相關(guān)，所以認(rèn)為P16蛋白表達(dá)雖然尚不能替代高危型人乳頭狀瘤病毒檢測，但仍可作為宮頸癌病變程度的指標(biāo)，為篩查和預(yù)后治療提供依據(jù)［9-10］。它作為輔助的生物學(xué)標(biāo)志物，檢測方法簡單、易于操作、且費(fèi)用較低，具有廣闊的應(yīng)用前景［11］。

本文利用細(xì)胞蠟塊及免疫組化技術(shù)的優(yōu)勢，檢測宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)陽性標(biāo)本中P16蛋白的表達(dá)，行P16檢測的同時(shí)，患者仍然按目前宮頸癌篩查步驟進(jìn)一步檢測、確診。由本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，從ASC?UC到HSIL的各級(jí)別病變中，P16的陽性率逐步增高，在ASC?H和HSIL的陽性表達(dá)率極高，且大多呈強(qiáng)陽性的表達(dá)，P16的著色強(qiáng)度隨病變的嚴(yán)重度而遞增，而ASC?H和HSIL多為彌漫整片細(xì)胞表達(dá)，且在胞核和胞質(zhì)均著色，染色強(qiáng)度也隨著宮頸病變程度的加重而增強(qiáng)，可見P16蛋白的表達(dá)與CINII級(jí)及以上病變具有較高的相關(guān)性，即將P16蛋白的表達(dá)指標(biāo)作為宮頸液基細(xì)胞學(xué)篩查輔助具有一定的可行性。因此顯示出P16可以輔助宮頸病變的分級(jí)診斷，從而使不同醫(yī)師的診斷有一致性，為臨床提供更可靠的依據(jù)，而且通過上述結(jié)果更證實(shí)了P16對(duì)宮頸癌前的高度病變和宮頸癌有較高的敏感性。該技術(shù)的應(yīng)用讓病理醫(yī)生能獲取更多的診斷信息，特別對(duì)于基層醫(yī)院病理醫(yī)生較少的單位尤其適用［12］。另外，細(xì)胞塊切片可以清晰見到組織碎片，可以幫助判斷宮頸病變的嚴(yán)重程度。因此，我們認(rèn)為其預(yù)測結(jié)果與宮頸活檢這個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)來對(duì)比，判斷該預(yù)測結(jié)果的可靠程度，可以作為宮頸癌篩查的輔助診斷指標(biāo)。

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The dectection of P16 in cervical tumor saved in wax block by cervical fluid cytology

LIU Jingwen1，CHEN Li2，WU Qiuliang3
（1. Department of Pathology，the First Maternal and Child Health Hospital of Huizhou，Huizhou，Guangdong，China，516000；2. Department of Obstetrics and Gynecology，Humen Hospital，Dongguan，Guangdong，China，523900；3. Department of Cancer Prevention and Control，Sun Yat?Sen university，Guangzhou，Guangdong，China，510060）

［ABSTRACT］Objective To evaluate the significance of the expression of P16 in cellular wax block liquid based cytology of cervical screening. Methods Standardized patient (SP) immunohistochemistry detection of protein P16 was performed on 180 specimens. Results The positive rates of P16 in negative for intraepithelial lesion or malignancy (NILM), atypical squamous cell of undetermined significance (ASC?US), atypical squamous cells, cannot exclude a high?grade squamous intraepithelial lesion (ASC?H), low?grade squamous intraepithelial lesion(LSIL), high?grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) and squamous cell carcinoma (SCC) were 0%、5.63%、60.00%、30.23%、100.00% and 100.00%, respectively. There were only 73 patients who received the results of the biopsy, including 48 positive cases of P16 [with 33 cases of cervical intraepithelial neoplasiaⅡ(CINⅡ) or above] and 15 negative cases of P16 (with no CINⅡor above). Conclusion Cellular wax block P16 immunohistochemistry staining revealed that the expression of P16 protein was connected with the occurrence and development of cervical cancer, which may be used in the lesion classification of cervical cancer, and used as the auxiliary diagnostic indexes in the screening of cervical lesions.

［KEY WORDS］Cervical tumor；Liquid based cytology；Immunohistochemistry；Cellular wax block；P16

通訊作者：劉鏡文，E?mail：6615151@qq.com