苦參堿抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-1β、TNF-α分泌及機(jī)制研究

楊雪梅　吳　剛

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，恩施445000)

苦參堿抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-1β、TNF-α分泌及機(jī)制研究

楊雪梅吳剛①

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，恩施445000)

[摘要]目的：探討苦參堿抑制脂多糖(lipopolysaccharide ，LPS) 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子包括腫瘤壞死因子α (TNF-α) 、白細(xì)胞介素1β ( IL-1β)對Toll 樣受體4(TLR4) 、c-Jun 表達(dá)的影響。方法：購買并培養(yǎng)小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞株，分成四組，即空白對照組、苦參堿組、LPS組、苦參堿干預(yù)組，通過濃度為100 μg /L 的LPS DMEM孵育1 h，之后將LPS棄去，然后加入不含血清的DMEM 或125.25 mg /L 苦參堿DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)。分別收集上述四組細(xì)胞處理完畢后5、30、60、120 min 的細(xì)胞及培養(yǎng)液。通過PCR法檢測小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞TLR4及c-Jun mRNA 的表達(dá)，通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞c-Jun 蛋白的表達(dá)；通過ELISA法測定各組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β的分泌。結(jié)果：苦參堿誘導(dǎo)組與空白對照組相比，TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白的表達(dá)量和TNF-α及IL-1β分泌量各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LPS組各個時間點(diǎn)TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白的表達(dá)量和TNF-α及IL-1β分泌量明顯高于空白對照組，且高水平能夠維持2 h以上(P<0.05)；苦參堿干預(yù)組能夠有效的抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白的表達(dá)量，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β 的分泌量。結(jié)論：苦參堿可能通過抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞絲裂原活化的蛋白激酶信號通路上TLR4、c-Jun的過表達(dá)從而有效的降低終末炎癥因子TNF-α及IL-1β的釋放，進(jìn)而有效的抑制炎癥反應(yīng)，減輕內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的程度。

[關(guān)鍵詞]苦參堿；脂多糖；巨噬細(xì)胞；TLR4；c-Jun；IL-1β；TNF-α

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，可以誘導(dǎo)炎癥因子IL-1β、TNF-α 等的表達(dá)，導(dǎo)致組織受到損傷[1,2]。Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是巨噬細(xì)胞表明的受體，LPS通過識別該受體刺激信號傳導(dǎo)，進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞內(nèi)激活子蛋白1、核因子κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)，誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)[3]。c-Jun 是AP-1 的主要成分之一，是AP-1 的主要活性形式，主要參與LPS 胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

苦參堿是中藥苦參、山豆根和苦豆子的主要成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)靜及強(qiáng)心等多方面作用[4]，有學(xué)者研究結(jié)果顯示能夠有效的抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)[5,6]。本研究探討苦參堿抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子包括TNF-α 、IL-1β對TLR4、c-Jun 表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞株從北京生命科學(xué)院購買，苦參堿(含量>99%，熔點(diǎn)75.5～77.5℃)購自寧夏制藥廠；LPS購自Sigma 公司；多克隆抗體兔抗小鼠c-Jun、DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Gibco 公司；蛋白提取試劑盒購自碧云天公司；反轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒購自Promega 公司；TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RAW264.7 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)將RAW264.7 巨噬細(xì)胞凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，置于含有100 ml/L的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基上在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期，融合至80%以上時，將培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分組，即空白對照組、苦參堿組、LPS誘導(dǎo)組、苦參堿干預(yù)組，空白對照組使用不含有血清的DMEM對細(xì)胞進(jìn)行孵育，苦參堿組用濃度為125.25 mg/L的苦參堿DMEM培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行孵育，LPS組及苦參堿干預(yù)組分別以濃度為100 μg/L LPS 的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育1 h后，將LPS丟棄，之后分別加入無血清DMEM 或濃度為125.25 mg/L 苦參堿的DMEM 繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，四組細(xì)胞在不同時間點(diǎn)后將培養(yǎng)液及細(xì)胞收集。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄PCR對巨噬細(xì)胞TLR4、c-Jun mRNA表達(dá)的檢測將處理過的細(xì)胞采用4℃ PBS漂洗3次后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮去并收集到EP 管中，根據(jù)RNA提取試劑盒的步驟進(jìn)行提取RNA，并對其純度及完整性進(jìn)行檢測。之后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成cDNA。引物由xxx公司設(shè)計合成，引物序列如表1所示。

表1反轉(zhuǎn)錄PCR基因引物序列及產(chǎn)物堿基數(shù)

Tab.1Primer seqnences for RT-PCR and size of gene product

GenePrimerSize(bp)TLR4-Forward5'-TCTGCCTTCACTACAGAGACT-3'TLR4-Reveres5'-AGTCTTCTCCAGAAGATGTGC-3'318c-Jun-Forward5'-CGGACCGTTCTATGACTGC-3'c-Jun-Reveres5'-AGCGTGTTCTGGCTATGC-3'394β-actin-Forward5'-TTGTTACCAACTGGGACG-3'β-actin-Reveres5'-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3'662

PCR反應(yīng)體系由10 μl 5×緩沖液、2 μl 25 mmol/L MgSO4、1 μl 10 mmol/L dNTP、2 μl上游引物和下游引物、1 μl AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、1 μl DNA 聚合酶、1 μl 1 ng/μl RNA、32 μl焦碳酸二乙酯處理水組成；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行半定量分析，表達(dá)方式為目的基因RNA量/β-actin量。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)法測定巨噬細(xì)胞c-Jun的表達(dá)對處理過的巨噬細(xì)胞在室溫下用濃度為40 g/L 多聚甲醛固定30 min，PBS處理30 min、過氧化氫(30 ml/L)封閉10 min、山羊血清(50 ml/L)封閉10 min；加兔抗小鼠c-Jun抗體(1∶200)37℃孵育2 h，洗滌后加山羊抗兔IgG二抗(1∶200)，37℃孵育1.5 h；經(jīng)過顯色、復(fù)染、封片及圖片采集后判讀結(jié)果，即c-Jun陽性細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)為棕黃色，c-Jun陰性細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)著色為藍(lán)色。計算3個高倍鏡視野下所有細(xì)胞及c-Jun陽性細(xì)胞，計算c-Jun陽性細(xì)胞率。

1.2.4ELISA法測定培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1β，TNF-α 的含量按照ELISA試劑盒說明書檢測收集的培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量。

2結(jié)果

2.1苦參堿對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)影響研究從圖1和表2中可以看出TLR4 mRNA表達(dá)量在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經(jīng)過誘導(dǎo)后5 min，TLR4 mRNA表達(dá)量瞬間達(dá)到高峰，2 h內(nèi)始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 與LPS組相比，苦參堿干預(yù)組在苦參堿處理后5 min，TLR4 mRNA表達(dá)量明顯降低，隨著時間的推移，在30、60、120 min 時與LPS組相同時間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，120 min時，mRNA表達(dá)量仍明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2苦參堿對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞c-Jun mRNA表達(dá)影響研究從圖2及表3中可以看出c-Jun mRNA 表達(dá)在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經(jīng)過誘導(dǎo)后5 min，c-Jun mRNA表達(dá)量瞬間達(dá)到高峰，2 h內(nèi)始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 與LPS組相比，苦參堿干預(yù)組在苦參堿處理后5 min，TLR4 mRNA表達(dá)量明顯降低，隨著時間的推移，而僅在120 min 時與LPS組相同時間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3苦參堿對LPS誘導(dǎo)后的小鼠巨噬細(xì)胞c-Jun 蛋白表達(dá)水平的影響從表4中可以看出c-Jun 陽性細(xì)胞數(shù)在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經(jīng)過誘導(dǎo)后5 min，c-Jun 陽性細(xì)胞數(shù)目瞬間達(dá)到高峰，2 h內(nèi)始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 與LPS組相比，苦參堿干預(yù)組在苦參堿處理后5 min，c-Jun 陽性細(xì)胞數(shù)目明顯降低，隨著時間的推移，在30、60、120 min 時與LPS組相同時間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，至120 min時，c-Jun 陽性細(xì)胞數(shù)目與空白對照組陽性細(xì)胞數(shù)相當(dāng)，相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1　苦參堿對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)影響Fig.1　Matrine promotes TLR4 mRNA expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS Note: M.Marker；1.Control group；2.LPS group；3.Matrine group；4.Matrine intervention group.

圖2　苦參堿對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞c-Jun mRNA表達(dá)影響Fig.2　Matrine promotes c-Jun mRNA expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS Note: M.Marker；1.Control group；2.LPS group；3.Matrine group；4.Matrine intervention group.

2.4苦參堿對LPS 誘導(dǎo)后小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β 水平的影響從表5中可以看出IL-1β在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經(jīng)過誘導(dǎo)后5 min，IL-1β水平瞬間達(dá)到高峰，2 h內(nèi)始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組相比，苦參堿干預(yù)組在苦參堿處理后5 min，IL-1β明顯降低，隨著時間的推移，在60、120 min 時與LPS組相同時間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；苦參堿干預(yù)組各時間點(diǎn)的IL-1β 含量明顯高于空白對照組，相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5苦參堿對LPS 誘導(dǎo)后小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α 水平的影響從表6中可以看出TNF-α在苦參堿組與空白對照組處理后各個時間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與空白對照組相比，LPS組經(jīng)過誘導(dǎo)后5 min，TNF-α水平瞬間達(dá)到高峰，2 h內(nèi)始終未見降低，明顯高于空白對照組，兩組各時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 與LPS組相比，苦參堿干預(yù)組在苦參堿處理后5 min，TNF-α明顯降低，隨著時間的推移，與LPS組相同時間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；苦參堿干預(yù)組各時間點(diǎn)TNF-α 含量高于空白對照組對照組，相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2苦參堿對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)影響

Tab.2Matrine promotes TLR4 mRNA expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS

GroupsTLR4mRNA5min30min60min120minControlgroup0.40±0.050.40±0.050.40±0.050.39±0.04LPSgroup0.72±0.091)0.71±0.081)0.77±0.061)0.76±0.081)Matrinegroup0.40±0.020.43±0.030.42±0.030.43±0.02Matrineinterventiongroup0.68±0.083)0.55±0.072)3)0.51±0.062)3)0.47±0.052)3)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group.

表3苦參堿對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞c-Jun mRNA表達(dá)影響

Tab.3Matrine promotes c-Jun mRNA expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS

Groupsc-JunmRNA5min30min60min120minControlgroup0.30±0.040.35±0.040.39±0.030.38±0.03LPSgroup0.81±0.111)0.80±0.121)0.77±0.131)0.82±0.121)Matrinegroup0.33±0.020.34±0.030.32±0.030.33±0.02Matrineinterventiongroup0.78±0.063)0.44±0.072)3)0.42±0.062)3)0.41±0.042)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group．

表4苦參堿對LPS誘導(dǎo)后的小鼠巨噬細(xì)胞c-Jun蛋白表達(dá)水平的影響(%)

Tab.4Matrine promotes c-Jun protein expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS(%)

Groupsc-Junprotein5min30min60min120minControlgroup19.11±2.9320.02±3.0120.01±2.9420.05±2.96LPSgroup54.23±7.821)55.77±8.011)56.18±8.021)53.79±8.221)Matrinegroup19.22±2.6720.07±2.9820.02±2.9620.08±2.98Matrineinterventiongroup49.33±7.633)33.55±4.762)3)24.71±3.912)3)21.33±3.322)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group．

表5苦參堿對LPS 誘導(dǎo)后小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β 水平的影響(pg/ml)

Tab.5Matrine promotes IL-1β expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS(pg/ml)

GroupsIL-1β5min30min60min120minControlgroup9.11±1.939.02±2.019.01±1.949.05±1.96LPSgroup48.32±6.821)47.77±7.011)49.18±7.021)49.79±7.221)Matrinegroup9.22±1.679.07±1.989.02±1.969.08±1.95Matrineinterventiongroup46.35±7.662)3)38.57±4.782)3)28.75±3.912)3)19.34±2.972)3)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group．

表6苦參堿對LPS 誘導(dǎo)后小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α 水平的影響(μg/ml)

Tab.6Matrine promotes TNF-α expression in RAW264.7 macrophages in mice induced by LPS(μg/ml)

GroupsTNF-α5min30min60min120minControlgroup0.23±0.030.24±0.040.26±0.030.26±0.02LPSgroup0.86±0.091)0.89±0.081)0.88±1.011)0.87±0.091)Matrinegroup0.24±0.020.25±0.030.25±0.020.27±0.03Matrineinterventiongroup0.76±0.062)3)0.63±0.052)3)0.55±0.042)3)0.38±0.022)3)

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with LPS group；3)P<0.05 compared with control group.

3討論

機(jī)體內(nèi)一種重要的免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，它是機(jī)體免疫防御作用的一道重要防線，巨噬細(xì)胞表面有眾多病原相關(guān)分子模式的模式識別受體。在這些模式識別受體中，TLR4 顯得較為重要，是重要的模式識別受體之一。而LPS 是G-菌的主要的病原相關(guān)分子模式[7]。眾所周知，G-菌侵入到機(jī)體死亡后，菌體裂解釋放大量的LS到機(jī)體血液系統(tǒng)內(nèi)，LPS即可結(jié)合到與血液中游離的巨噬細(xì)胞膜表面TLR4上，從而有效的激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化的蛋白激酶和NF-κB等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。MAPK相關(guān)信號通路通過LPS被激活，激活后的信號通路上的c-JunN 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)活化使c-Jun蛋白N-末端磷酸化，使AP-1形成。AP-1一種穩(wěn)定的異源二聚體，主要通過Jun與Fos 蛋白相互嵌合形成的，是細(xì)胞中的一種活性形式，AP-1結(jié)合位點(diǎn)位于基因啟動子區(qū)域，AP-1可以結(jié)合到該位點(diǎn)，從而使炎癥因子相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，使IL-1β、TNF-α炎癥因子表達(dá)增強(qiáng)[8-10]。有學(xué)者研究顯示通過有效阻斷TLR4 及AP-1的激活能夠有效的降低LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[11-14]。

苦參堿是豆科植物苦參中的重要的成分之一，具有廣泛的藥理作用，目前已在臨床上廣泛應(yīng)用[15]，有學(xué)者研究顯示苦參堿能顯著抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF,以及細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肝臟枯否細(xì)胞釋放TNF 和IL-6 ,并能降低小鼠血清TNF 和IL-6 水平,從而有效的減輕肝臟、腎臟及肺臟等組織器官炎性損傷[16，17]。TNF-α、IL-1β是眾多的炎癥因子中學(xué)者們關(guān)注較多的炎癥介質(zhì)，主要與內(nèi)毒素造成疾病有關(guān)[18]。本研究通過LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞1 h后，在轉(zhuǎn)至無血清DMEM 經(jīng)過5 min的培養(yǎng)后，炎癥因子TNF-α、IL-1β的分泌已經(jīng)達(dá)到高峰，且維持2 h保持不變。當(dāng)給予LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞苦參堿處理5 min后發(fā)現(xiàn)，炎癥因子TNF-α、IL-1β的分泌明顯降低，說明，苦參堿對與LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的分泌具有明顯的抑制作用，且隨著時間的推移，對炎癥因子的抑制作用越強(qiáng)，這也進(jìn)一步說明苦參堿是通過抑制炎癥因子的過表達(dá)而參與了機(jī)體的抗炎癥反應(yīng)的過程。

LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞1 h后，再轉(zhuǎn)至無血清DMEM中培養(yǎng)5 min后，炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)趨勢與TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白表達(dá)趨勢基本一致，說明TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun的表達(dá)與炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)有明顯的相關(guān)性。故通過抑制TLR4、c-Jun 基因及蛋白的表達(dá)，能夠有效的改善內(nèi)毒素血癥患者最后的結(jié)局，本研究通過苦參堿干預(yù)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示在苦參堿干預(yù)5 min時，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TLR4、c-Jun 的mRNA 轉(zhuǎn)錄及c-Jun 蛋白表達(dá)明顯降低，雖然苦參堿對TLR4、c-Jun 的mRNA 轉(zhuǎn)錄及c-Jun 蛋白發(fā)揮抑制作用顯示的時間點(diǎn)有所不同，但從總體上來說是一致的，說明苦參堿抑制LPS造成的炎癥因子的過表達(dá)與絲裂原活化的蛋白激酶通路有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞1 h后再加入苦參堿培養(yǎng)5 min后，TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白表達(dá)與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明苦參堿能夠有效的抑制絲裂原活化的蛋白激酶通路上TLR4 mRNA、c-Jun mRNA及c-Jun 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)。

總之，苦參堿可能通過抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞絲裂原活化的蛋白激酶信號通路上TLR4、 c-Jun的過表達(dá)從而有效的降低終末炎癥因子IL-1β、TNF-α 的釋放，進(jìn)而有效的抑制炎癥反應(yīng)，減輕內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)的程度。

參考文獻(xiàn)：

[1]Takaoka Y，Goto S，Nakano T，etal.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)prevents lipopolysaccharide(LPS)-induced，sepsis-related severe acute lung injury in mice[J].Sci Rep,2014,4:5204.

[2]Christoph R,Thomas H.Systematic review of membrane components of gram-positive bacteria responsible as pyrogens for inducing human monocyte/macrophage cytokine release[J].Front Pharmacol,2012,3:56.

[3]Molinaro A,Holst O,Di Lorenzo F,etal.Chemistry of lipid A:At the heart of innate immunity[J].Chemistry,2015,21(2):500-519.

[4]馮曉,湯煥梅,沈烈行.苦參堿的藥理學(xué)研究概況[J].藥物流行病學(xué)雜志,2005,14(6):331 -333.

[5]呂建芳,范恒,沈霖,等.氧化苦參堿對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜細(xì)胞因子和核因子-κB p65表達(dá)的影響[J].世界華人消化雜志,2008，16(36):2289-2294

[6]聶紅明,陳建杰,高月求,等.苦參堿與氧化苦參堿體外抗乙肝病毒的比較[J].世界華人消化雜志，2008，16(36):4046-4050.

[7]Christoph R,Thomas H.Systematic review of membrane components of Gram-positive bacteria responsible as pyrogens for inducing human monocyte/macrophage cytokine release[J].Front Pharmacol,2012,3:56.

[8]Keshet Y，Seger R.The MAP kinase signaling cascades:a system of hundreds of components regulates adiverse array of physiological functions[J].Methods Mol Biol,2010,661:3-38.

[9]Chen X,Zong C,Gao Y,etal.Curcumol exhibits anti-inflammatory properties by interfering with the JNK-mediated AP-1 pathway in lipopolysaccharide-activated RAW264.7 cells[J].Eur J Pharmacol,2014,723:339-345.

[10]崔樹娜,Bilitewski.金雀異黃素對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MAPK和TLR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2014,30(3):233-236.

[11]Fengyang L，Yunhe F，Bo L，etal. Stevioside suppressed inflammatory cytokine secretion by downregulation of NF-kappaB and MAPK signaling pathways in LPS-stimulated RAW264.7 cells[J].Inflammation,2012,35(5):1669-1675.

[12]Ji G，Chen R，Zheng J.Atractylenolide I inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory responses via mitogen-activated protein kinase pathways in RAW264.7 cells[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2014,36(6):420-425.

[13]Oh YC，Jeong YH，Cho WK，etal.Lactobacilli-fermented Hwangryunhaedoktang has enhanced anti-inflammatory effects mediated by the suppression of MAPK signaling pathway in LPS-stimulated RAW264.7 cells[J].Pharmacogn Mag,2014,10(Suppl 3):S645-S654.

[14]Chun JM，Nho KJ，Kim HS，etal. An ethyl acetate fraction derived from houttuynia cordata extract inhibits the production of inflammatory markers by suppressing NF-кB and MAPK activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages[J].BMC Complement Altern Med，2014，14:234.

[15]張麗華,陳邦恩,潘明佳.苦參堿藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2009,40(6)：1000-1003.

[16]林文,張俊平,胡振林,等.苦參堿對細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)大鼠枯否細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子及白細(xì)胞介素-6 的影響[J].藥學(xué)學(xué)報,1997,32(2):93-96.

[17]張俊平,胡振林,林文,等.苦參堿對巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子及其蛋白激酶C 活性的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,1995,16(6):513-514.

[18]Cho BO,Ryu HW,So Y，etal.Anti-inflammatory effect of mangostenone F in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages by suppressing NF-κB and MAPK activation[J].Biomol Ther(Seoul),2014,22(4):288-294.

[收稿2015-09-22修回2015-11-12]

(編輯許四平)

Inhibitory effect of Matrine on IL-1β，TNF-α of macrophages induced by LPS

YANG Xue-Mei,WU Gang.

Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture,Enshi 445000,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of Matrine on inhibiting lipopolysaccharide(lipopolysaccharide ，LPS) - induced macrophages to secrete inflammatory cytokines,including tumor necrosis factor-α (TNF-α),leukocyte mediated element 1β (IL-1β) on Toll like receptor 4 (TLR4),c-jun expression.Methods: Cultured macrophage RAW264.7 of mouse and divided into four groups,including blank control group,matrine group,LPS group,matrine intervention group.Incubated by the concentration was 100 μg/L LPS DMEM for 1 h,then the LPS was discard.Added free serum DMEM or 125.25 mg/L matrine DMEM to culture.The cells and culture solution of 5,30,60,120 min after the treatment of the above four groups were collected respectively.Detected of mouse RAW264.7 macrophage TLR4 and c-jun mRNA expression by PCR.Detected of mouse macrophage RAW264.7 cells c-jun protein expression by immunocytochemical.Measured secretion in cultured solution of TNF-α and IL-1β by ELISA.Results: Expression TLR4 mRNA,c-jun mRNA and c-jun protein and TNF -α and IL-1β secretion quantity indexes of matrine induced and blank group had no statistical significant differences (P>0.05).TLR4 mRNA，c-jun mRNA and c-jun protein expression secretion of and TNF-α and IL-1β LPS group at each time point were significantly higher than that of blank group,and the high level to maintain more than 2 h (P<0.05);matrine intervention group could effectively inhibit LPS induced macrophage TLR4 mRNA,c-jun mRNA and c-jun protein expression and reduce the secretion of inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β.Conclusion: Matrine may inhibit LPS induced macrophage mitogen activated protein kinase signal pathway of TLR4 and c-jun expression so that it can effectively reduce the end inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β release,effectively inhibit the inflammatory reaction and reduce the degree of endotoxin inflammatory response.

[Key words]Matrine;Lipopolysaccharide;Macrophage;TLR4;c-Jun;IL-1β;TNF-α

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.011

作者簡介：楊雪梅(1969年-),女,副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)方面的研究，E-mail:yxm1969_22@sina.com。

中圖分類號R967

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0820-05

①湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)教研室，恩施445000。