劉琳琳，葉國軍，江永忠，方斌，李翔，肖紅雨，李國明

湖北省疾病預防控制中心，武漢 430079

·論著·

2013
—2014年湖北省外環(huán)境中禽流感病毒污染情況分析

劉琳琳，葉國軍，江永忠，方斌，李翔，肖紅雨，李國明

湖北省疾病預防控制中心，武漢 430079

摘要：為了解2013—2014 年湖北省外環(huán)境中禽流感病毒污染情況，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)對全省7個監(jiān)測點1 642份活禽相關外環(huán)境標本進行禽流感病毒型別與陽性率監(jiān)測。結(jié)果顯示，2013—2014年湖北省外環(huán)境中禽流感病毒平均陽性檢出率為19.1%，檢出的禽流感病毒型別以H9亞型為主(占57.3%)，未檢出H7亞型。不同地區(qū)和季節(jié)禽流感病毒陽性率有所差異，鄂西北冬春季病毒檢出陽性率高于鄂西南和江漢平原；家禽屠宰加工廠檢出陽性率最高；陽性率最高的標本來自清洗禽類的污水。結(jié)果提示，湖北地區(qū)外環(huán)境中禽流感病毒陽性率較高，且型別多樣，家禽屠宰加工人員對禽流感病毒有較高的暴露風險，需加強健康宣教，提高個人防護意識。

關鍵詞：禽流感；外環(huán)境；污染

禽流感(avian influenza)是由A型流感病毒的任何一個亞型引起各種家禽及野生禽類感染或發(fā)生疫病的一種傳染性疾病[1]，人禽流感是人接觸禽流感病毒感染動物的排泄物或分泌物并出現(xiàn)以呼吸道感染、黏膜充血等癥狀為主要表現(xiàn)的人禽共患病[2]。我國自2004 年初開始報告動物禽流感疫情，2005 年10月湖南省報告了中國大陸首例人禽流感確診病例[3]，2006年4月及2010年6月湖北省分別確診一例人感染高致病性禽流感病例[4-5]。2013年3月30日我國確診3例人感染H7N9禽流感病例，為全球首次發(fā)現(xiàn)人感染H7N9禽流感病毒[6]。2013—2014年我國人感染H7N9禽流感情況嚴重，至2014年6月4日中國內(nèi)地共確診433例，死亡163例。病例分布在14個省市，報告病例數(shù)前5位省市為浙江、廣東、江蘇、上海、湖南[7]。湖北省H7N9 禽流感發(fā)病率處于全國前列，但2013—2014 年期間未發(fā)生人感染H7N9禽流感病例。湖北省處于水網(wǎng)區(qū)域，且活禽市場、禽類養(yǎng)殖場繁多，自然環(huán)境和人群生活習慣亦為人與家禽及野生禽類接觸提供了更多機會，因此存在人禽流感疫情發(fā)生和蔓延的危險因素。本研究對湖北省2013—2014 年外環(huán)境中禽流感病毒污染狀況進行研究，評估湖北省禽流感疫情發(fā)生風險，為當?shù)匾咔榉揽靥峁┮罁?jù)。

1材料與方法

1.1監(jiān)測點設置

根據(jù)湖北省各城市以往人間與禽間禽流感發(fā)生情況及地理位置，選擇東南、西北及湖網(wǎng)地區(qū)的荊州、十堰、宜昌、襄陽、鄂州、隨州、武漢共7個城市作為監(jiān)測城市，每個監(jiān)測點選取城鄉(xiāng)活禽市場、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(戶)、家禽散養(yǎng)戶集中區(qū)、家禽屠宰加工廠及野生候鳥棲息地作為監(jiān)測場所。

1.2標本采集

每月在每個監(jiān)測點采集外環(huán)境監(jiān)測標本，包括監(jiān)測點內(nèi)的水樣、禽類(含候鳥)糞便及籠具表面擦拭物。標本采集使用北京友康科技有限公司的病毒采樣管。采集環(huán)境樣本時，用隨管配備的醫(yī)用棉拭子涂抹禽類籠具內(nèi)壁、籠具中或養(yǎng)殖場地面新鮮糞便、宰殺和擺放禽肉的砧板表面或處理禽類的污物桶和褪毛機等，然后將棉拭子放入含采樣液的螺旋管內(nèi)。2013及2014年分別采集外環(huán)境標本811份和831份。

1.3外環(huán)境標本核酸檢測

由中國國家流感中心提供H5、H7、H9型禽流感病毒引物和探針序列，具體見表1。

表1本研究所用引物

Tab.1Primers used in the study

Primer/probe Sequence H5-Forward5'-TGGAAAGTRTAARAAACGGAACGT-3'H5-Reverse5'-YGCTAGGGARCTCGCCACTG-3'H5-Probe5'-TACCCGCAGTATTCAGAAGAAGC-BHQ1-3'H7-Forward5'-AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA-3'H7-Reverse5'-GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG-3'H7-Probe5'-FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3'H9-Forward5'-CAAGCTGGAATCTGARGGAACTTACA-3'H9-Reverse5'-GCATCTGCAAGATCCATTGGACAT-3'H9-Probe5'-CCCAGAACARGAAGGCAGCAAACCCCATTG-BHQ1-3'

采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)對外環(huán)境標本進行禽流感病毒核酸檢測。所用儀器為PCR儀(ABI 7300，273003117)、核酸自動提取儀(西安天隆科技有限公司，NP968，TL101211230)。試劑為病毒RNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)、實時PCR 檢測試劑盒(Allen-Bradley公司，貨號4387391)。配制反應體系：2×RT-PCR Buffer 12.5 μL、25×RT-PCR Enzyme Mix 1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、探針0.5 μL、RNase Free Water 5 μL，加雙蒸水至20 μL。將上述反應液混勻，分裝到0.2 mL PCR小管中，每管20 μL，分別做好標記。將分裝好的PCR小管加入模板，首先加入陰性對照管(5 μL無菌水)，然后分別加入標本RNA(每管5 μL)，最后加入陽性對照RNA(每管5 μL)?；靹?，短暫離心后放入PCR儀進行RT-PCR擴增：45 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s， 40個循環(huán)；60 ℃ 45 s， 40個循環(huán)。

循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)≤35的標本直接判定為陽性；對于Ct值在35～40的可疑標本，需通過實時RT-PCR擴增曲線、擴增Ct值、平行重復樣本和陰陽性對照品等綜合判定(當可疑標本和平行重復標本Ct值均在35～40且均具有“S”形擴增曲線時判定為陽性，否則為陰性)； Ct值>40的標本判定為陰性。

1.4統(tǒng)計學分析

用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗比較組間病毒檢測陽性率差異。

2結(jié)果

2.1湖北省2013 和2014年禽流感病毒監(jiān)測結(jié)果

2013年采集外環(huán)境標本811份，禽流感病毒核酸陽性136份，總陽性率為16.8%。其中H9陽性52份，占38.2%；H5陽性8份，占5.9%；其他亞型(FluA陽性且H5、H7、H9陰性)58份，占42.6%；H5和H9混合陽性18份，占13.2%；無H7陽性標本。2014年采集外環(huán)境標本831份，禽流感病毒核酸陽性178份，總陽性率為21.4%。其中H9陽性128份，占71.9%；H5陽性6份，占3.4%；其他亞型陽性35份，占19.7%；H5和H9混合陽性9份，占5.0%；無H7陽性標本，但H7 陽性對照標本均為RT-PCR 陽性。

2.2湖北省不同區(qū)域監(jiān)測點禽流感病毒檢測結(jié)果

2013年設武漢、荊州、十堰、襄陽、鄂州、宜昌共6個城市為禽流感病毒監(jiān)測點。其中武漢、荊州、十堰、襄陽監(jiān)測點均檢測到禽流感病毒，陽性率為6.6%～43.4%，以襄陽監(jiān)測點檢出率最高(59，43.4%)，荊州最低(9，6.6%)(表2)。然而，鄂州和宜昌采集的各120份標本均未檢出病毒核酸。

2014年在上述6 個城市的基礎上增加了隨州為禽流感病毒監(jiān)測點。檢測結(jié)果顯示，除宜昌外，其他6個城市監(jiān)測點所采集的標本禽流感病毒核酸陽性率為9.0%～28.1%，以襄陽監(jiān)測點檢出率最高(50，28.1%)，荊州最低(16，9.0%)(表2)。

表2湖北不同區(qū)域外環(huán)境標本禽流感病毒監(jiān)測結(jié)果

Tab.2Avian influenza virus in external environment in different districts in Hubei

YearCityPositivesampleTotalH5H7H9H5+H9Others2013Ezhou0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)Jingzhou9(6.6%)3(2.2%)0(0)0(0)0(0)6(4.4%)Shiyan31(22.8%)0(0)0(0)21(15.4%)9(6.6%)1(0.7%)Wuhan37(27.2%)1(0.7%)0(0)20(14.7%)7(5.1%)9(6.6%)Xiangyang59(43.4%)4(2.9%)0(0)11(8.1%)2(1.5%)42(30.9%)Yichang0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)2014Ezhou30(16.9%)0(0)0(0)30(16.9%)0(0)0(0)Jingzhou16(9.0%)0(0)0(0)7(3.9%)0(0)9(5.1%)Shiyan40(22.5%)0(0)0(0)32(18.0%)5(2.8%)3(1.7%)Wuhan17(9.6%)1(0.6%)0(0)6(3.4%)1(0.6%)9(5.1%)Xiangyang50(28.1%)5(2.8%)0(0)28(15.7%)3(1.7%)14(7.9%)Yichang0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)Suizhou25(14.0%)0(0)0(0)25(14.0%)0(0)0(0)Total314(19.1%)14(0.9%)0(0)180(11.0%)27(1.6%)93(5.7%)

2.3不同季度標本禽流感病毒檢測結(jié)果

進而分析不同季度標本禽流感病毒檢測情況。2013年4個季度禽流感病毒檢測的陽性率分別為11.6%、14.2%、14.0%、27.4%，各季度間標本陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=23.480，P<0.01)。2014年4個季度禽流感病毒檢測的陽性率分別為12.0%、19.3%、26.3%、25.9%，各季度間標本陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.472，P<0.01)(表3)。結(jié)果提示，秋冬季禽流感活動水平較高。

表3不同季度外環(huán)境標本禽流感病毒監(jiān)測結(jié)果

Tab.3Avian influenza virus in external environment in different seasons

YearSeasonSamplePositiverate(%)SubtypeH5H7H9H5+H9Others2013119811.60(0)0(0)3(13.0%)2(8.7%)18(78.3%)219714.20(0)0(0)10(35.7%)6(21.4%)12(42.9%)321514.03(10.0%)0(0)16(53.3%)4(13.3%)7(23.3%)420127.45(9.1%)0(0)23(41.8%)6(10.9%)21(38.2%)2014117512.04(19.0%)0(0)6(28.6%)3(14.3%)8(38.1%)221219.31(2.4%)0(0)27(65.9%)2(4.9%)11(26.8%)322826.30(0.0%)0(0)51(85.0%)1(1.7%)8(13.3%)421625.91(1.8%)0(0)44(78.6%)3(5.4%)8(14.3%)Total164219.114(4.5%)0(0)180(57.3%)27(8.6%)93(29.6%)

2.4不同標本類型禽流感病毒檢測結(jié)果

2013及2014年外環(huán)境標本有6種，分別為禽類(含候鳥)糞便標本、籠具表面擦拭標本、禽類飲水標本、清洗禽類的污水標本、宰殺和擺放禽肉的砧板拭子標本及處理禽類的污物桶和褪毛機。每種標本檢出的禽流感病毒陽性率不同(圖1～2)，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=99.740，P<0.01；χ2=153.737，P<0.01)。檢出陽性率最高的標本來自清洗禽類的污水，構(gòu)成比最高的病毒型別為H9型，未檢出H7型禽流感病毒。

2.5不同監(jiān)測場所禽流感病毒檢測結(jié)果

2013年除家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(戶)和野生候鳥棲息地外，其余3類監(jiān)測場所均檢出禽流感病毒。其中以家禽屠宰加工廠陽性率最高，為44.9%，而家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)為8.6%，各監(jiān)測場所之間陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=144.138，P<0.01)。2014年除家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)和野生候鳥棲息地外，其余3類監(jiān)測場所均檢出禽流感病毒。仍以家禽屠宰加工廠陽性率最高，為55.0%，家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(戶)陽性率最低，為1.2%，各監(jiān)測場所之間陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=171.084，P<0.01)。詳見表4、圖3、圖4。

圖12013年禽流感病毒型別構(gòu)成比及各標本類型陽性率

Fig.1The constituent ratio of avian influenza viruses and positive rate of various samples in 2013

圖22014年禽流感病毒型別構(gòu)成比及各標本類型陽性率

Fig.2The constituent ratio of avian influenza viruses and positive rate of various samples in 2014

表4不同監(jiān)測場所外環(huán)境禽流感病毒監(jiān)測結(jié)果

Tab.4Avian influenza virus in external environment in different monitoring points

Monitoringpoint2013SamplePositivesample2014SamplePositivesampleLivepoultrymarket364102(28.0%)398131(32.9%)Poultryfarm2730(0)2553(1.2%)Concentratedareaoffree-rangepoultry353(8.6%)320(0.0%)Poultrydressingplant6931(44.9%)8044(55.0%)Migratorybirdhabitat700(0)660(0)Total811136(16.8%)831178(21.4%)

圖32013 年各監(jiān)測場所禽流感病毒檢出陽性率

Fig.3The positive rate of avian influenza virus in various monitoring points in 2013

圖42014年各監(jiān)測場所禽流感病毒檢出陽性率

Fig.4The positive rate of avian influenza virus in various monitoring points in 2014

3討論

本研究顯示，湖北省2013—2014年禽流感病毒在外環(huán)境中的陽性率為19.1%，在不同地區(qū)、季節(jié)、標本類型和監(jiān)測場所中均以H9亞型禽流感病毒為主，在兩年的監(jiān)測中未檢出H7亞型禽流感病毒，與湖北省2013—2014 年未發(fā)生人感染H7N9相符合。通過研究發(fā)現(xiàn)，鄂西北的襄陽、隨州、十堰病毒檢出率較高，而鄂西南及江漢平原的宜昌、荊州病毒檢出率很低甚至為零，提示禽流感病毒在湖北省分布不均。雖然禽流感病毒在全年均能檢測到，但不同季度病毒檢出率有差異。總體而言，秋冬季病毒陽性率為全年最高。各地應針對本地禽流感病毒時空分布情況進行防控策略制定。通過對涉禽環(huán)境的病毒監(jiān)測，本研究發(fā)現(xiàn)家禽屠宰加工廠環(huán)境中禽流感病毒陽性最高，陽性率最高的標本來自清洗禽類的污水，提示從事禽類屠宰加工為危險度較高的暴露方式，外環(huán)境中(特別是禽類零售攤點)存在人禽流感病毒污染，是導致人禽流感散發(fā)病例不時出現(xiàn)的原因。有研究表明，在越南2004年開始出現(xiàn)H5N1人禽流感病例之前，H5N1禽流感病毒已在市場外環(huán)境中存在超過3年。因此，加強活禽市場的管理和消毒依然是防止或減少人禽流感散發(fā)病例的關鍵。在野生候鳥棲息地未檢出禽流感病毒，可能與野鳥活動范圍大、采樣時間和采樣點選擇及標本數(shù)量少等有關。檢出的病毒類型除常見的H5、H9亞型及兩者混合型別外，還有很大比例(29.6%)為其他型別，這與國內(nèi)其他報道相一致[8-9]。2014年以來，湖北省周邊省份均發(fā)現(xiàn)人感染禽流感新型病毒，如江西省人感染H10N8禽流感病毒[10]、廣東省人感染H5N6禽流感病毒[11]，且在患者生活的外環(huán)境中溯源到相關病毒，均提示外環(huán)境中禽流感病毒是人類感染的源頭。2015年以來，湖南省和江蘇省等地禽類養(yǎng)殖場暴發(fā)H5N6高致病性禽流感疫情[12]，中國臺灣地區(qū)首次出現(xiàn)全球新型H5N2高致病性禽流感，河南省和山西省等地還發(fā)生候鳥野鴨因H5N1高致病性禽流感死亡事件，加之國內(nèi)活禽交易市場間活禽往來頻繁，增加了外環(huán)境中禽流感病毒交叉污染和暴露的風險，需引起特別關注。

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Avian influenza viruses in environmental samples collected in Hubei Province, 2013-2014

LIU Linlin, YE Guojun, JIANG Yongzhong, FANG Bin, LI Xiang, XIAO Hongyu, LI Guoming

Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention, Wuhan 430079, China

Abstract:To investigate the situation of environmental pollution by avian influenza virus in Hubei Province, 2013-2014, 1 642 live-bird related environmental samples collected from 7 monitoring points were detected by real-time polymerase chain reaction (PCR). The virus types and positive rates were analyzed. The results showed that the positive rates of avian influenza virus in 2013 and 2014 were 16.8% and 21.4%, respectively. The leading virus subtype was H9 (57.3%). H7 avian influenza virus was not detected. The positive rates in different areas and seasons were different. The positive rate of northwest in Hubei Province was higher than that of southeast and Jianghan Plain. The poultry dressing plant had the highest detection rate. The sample with highest positive rate was from poultry cleaning wastewater. The results suggest that the environment of Hubei Province has high detection rate of avian influenza virus, with various types. The people who work in poultry dressing plants have higher risk. Therefore health education should be strengthened to enhance the personal protection consciousness.

Key words:Avian influenza; External environment; Pollution

通信作者：李國明

Corresponding author. LI Guoming, E-mail: liguominghb@163.com

(收稿日期：2015-05-15)