牛曉艷（山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

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豬ITGB-5基因外顯子多態(tài)性及其與仔豬腹瀉的關(guān)聯(lián)性研究

牛曉艷
（山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

摘 要：采用PCR—測序的方法對豬ITGB-5基因所有17個外顯子進行擴增測序，經(jīng)多重比對后找到該基因內(nèi)的SNPs。對該基因外顯子內(nèi)所有SNPs進行Snap-shot分型并與黏附表型進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：ITGB-5外顯子內(nèi)共發(fā)現(xiàn)10個SNPs，其中有3個SNPs關(guān)聯(lián)分析結(jié)果呈現(xiàn)顯著，分別位于該基因的5號及13號外顯子。結(jié)合該基因的生物學功能以及本試驗的結(jié)果表明：ITGB-5可能是與仔豬腹瀉相關(guān)的基因。

關(guān)鍵詞：仔豬腹瀉；ITGB-5基因；Snap-shot分型；關(guān)聯(lián)分析

仔豬腹瀉是導致畜牧業(yè)損失的重要原因之一，由于仔豬腹瀉造成的損失占到畜牧業(yè)總產(chǎn)值的20%左右，腹瀉造成的死亡占仔豬總死亡數(shù)的40%左右。仔豬腹瀉常常導致飼料報酬率下降，生長發(fā)育遲緩，產(chǎn)生僵豬等。在所有腹瀉當中，由ETEC（產(chǎn)腸毒素大腸桿菌）引起的腹瀉是最為常見的一種，這種腹瀉發(fā)生的機理是以大腸桿菌和宿主小腸上皮細胞的黏附為前提，所以可以表達受體蛋白的個體為易感個體，不表達受體蛋白的個體為抗性個體。根據(jù)大腸桿菌表達菌毛的種類，又分為F4ab，F(xiàn)4ac和F4ad三種類型。ETEC粘附于豬小腸上皮細胞后，釋放毒素，導致腸道內(nèi)電解質(zhì)平衡紊亂，從而導致腹瀉。

豬ITGB-5基因位于豬13號染色體31q41區(qū)段。ITGB-5屬于整合素家族成員，編碼細胞表面糖蛋白，主要功能是參與免疫細胞的黏附作用。該基因在生物進程中具有多種功能，包括細胞生長和創(chuàng)傷修復時的細胞遷移，細胞變異和細胞凋亡，調(diào)節(jié)潛在的一些腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和癌細胞的擴散等。ITGB-5通常以二聚體的形式存在，包括α和β亞基，該異二聚體優(yōu)先結(jié)合在細胞黏附分子上，構(gòu)成細胞外基質(zhì)的成分。該基因已經(jīng)徐如海［1］等經(jīng)抑制消減雜交篩選技術(shù)而得到，可作為研究仔豬腹瀉的候選基因之一。

本研究基于PCR-測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬ITGB-5基因外顯子的SNPs，通過Snap-shot技術(shù)對該基因所有外顯子內(nèi)的SNPs進行分型，再經(jīng)卡方檢驗獲得其與黏附表型之間的關(guān)聯(lián)性。為進一步研究該基因和仔豬腹瀉之間的關(guān)系提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1試驗動物 試驗所采用的動物個體來源于中國農(nóng)科院畜牧所。是由大白，長白和松黑三個品種所組成的群體，該群體為兩代半同胞家系，包括366頭子代和77頭父母代個體。根據(jù)黏附表型，選取6頭黏附個體（case：Y）以及6頭非黏附個體（control：NY）作為測序反應(yīng)的試驗樣本，case組與control組之間無親緣關(guān)系。

1.1.2試驗試劑 PCR引物購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；超純dNTP，PCR反應(yīng)Buffer（10X），Taq酶，Marker DL2000，6X上樣緩沖液均購自Invitrogen公司；雙蒸水，II型瓊脂糖為實驗室自備。

SNP基因型分型：Snapshot委托上海捷瑞生物公司進行。

用于測量黏附表型的菌株分別為：195（F4ab，C83901，O8；K87，豬源），200（F4ac，C83907，O149：K91，豬源），216（F4ad，C83923，O8：K87，豬源），238（C83286，O38：K99，牛源，陰性對照菌）。以上菌株均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.3引物設(shè)計 通過軟件Primer 3.0對ITGB-5基因的外顯子區(qū)域進行在線引物設(shè)計，用于PCR反應(yīng)的引物如下表所示：

表1　ITGB-5引物序列

1.2試驗方法

1.2.1黏附表型測定 三個品種小腸上皮細胞與大腸桿菌菌毛之間的黏附情況通過顯微鏡觀察后記錄［2］。根據(jù)小腸上皮細胞吸附大腸桿菌的個數(shù)，分為黏附（Y）和非黏附（NY）兩種類型。

黏附標準采用單個小腸上皮細胞：黏附多于5個細菌為黏附。

1.2.2DNA提取 取大小為1 g的耳組織樣本，放入Eppendorf管中剪碎。耳組織DNA提取過程采用《分子克隆試驗指南》中所提供的酚-氯仿法［3］，提取獲得的DNA用雙蒸水溶解后，將樣品在50 ℃下放置1小時，滅DNA酶。

1.2.3PCR反應(yīng)體系和條件 PCR反應(yīng)體系：DNA模板（50～75 ng/ul）：1.5 ul；上游引物（10 μmol/L）：0.5 ul，下游引（10 μmol/L）：0.5 ul；dNTP（10 μmol/L）：1.6 ul；Buffer：2.0 ul；Taq酶（5 U/ul）：0.4 ul；ddH2O：14.1～14.6 ul。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃預變性30 s，55 ℃～65 ℃退火30～45 s，72 ℃延伸30～45 s，72 ℃終末延伸7 min～10 min，20 ℃保存。

1.2.4測序比對 將PCR產(chǎn)物收集后送至北京三博遠志公司進行測序分析。測序結(jié)果用Chromas軟件判讀。部分片段（F1，F(xiàn)3，F(xiàn)6，F(xiàn)9）由于片段內(nèi)存在高GC含量的區(qū)域（在70%以上），普通測序反應(yīng)無法實現(xiàn)，采用克隆測序的方法進行。

質(zhì)粒小提：質(zhì)粒小提采用試劑盒進行。

克隆測序：將PCR產(chǎn)物切膠回收后與T-easy載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，將培養(yǎng)獲得的陽性菌落送公司進行克隆測序。

測序結(jié)束后將所獲得的試驗個體各外顯子的序列采用DNAMAN進行多序列比對，獲得各外顯子內(nèi)SNPs和片段缺失的信息。

1.2.5Snapshot分型

對選定區(qū)段的DNA擴增樣本進行混池后采用多重PCR進行分型。加入熒光染料后，在ABI3730核酸檢測儀上進行測序分析，收集熒光信號，并對分型結(jié)果進行總結(jié)。

1.3統(tǒng)計分析

統(tǒng)計F4ab和F4ac黏附（Y）以及非黏附（NY）個體在群體內(nèi)的基因型頻率。對各SNPs在群體中進行卡方檢驗，檢驗統(tǒng)計量為：自由度df=k-1，即自由度df=3+3-1=5，經(jīng)檢驗獲得ITGB-5內(nèi)顯著的SNPs。

2　實驗結(jié)果

2.1黏附表型檢測

經(jīng)顯微鏡觀察，得到兩組個體的體外黏附結(jié)果，如表2所示：

表2　Case-control設(shè)計所選擇的樣本

2.2測序結(jié)果

2.2.1ITGB-5基因各外顯子內(nèi)的突變 對ITGB-5進行測序后結(jié)果如下表所示：

由測序結(jié)果可以看出，在ITGB-5基因的5號，6號，7號以及11，13，16號和17號外顯子內(nèi)，均發(fā)現(xiàn)一些SNPs，在17號外顯子內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了一個SEXA1的酶切位點。

表3　ITGB-5外顯子測序結(jié)果

2.2.2酶切位點 通過在線的分子生物學軟件（http：//rna.Lundberg.gu.se/cuttter2/）對ITGB-5基因外顯子進行酶切位點預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因外顯子5，6，7，11，13，16內(nèi)的突變位點為非酶切位點，而17號外顯子中存在酶切位點SEXAI。進一步分析這些酶切位點和黏附表型間的關(guān)系，檢測了7個黏附型個體和7個非黏附型個體，但這些個體的酶切基因型和黏附表型之間并沒有關(guān)聯(lián)關(guān)系，所以認為試驗檢測到的酶切位點并非因果突變。

在第17號外顯子中存在SEXA1酶切位點，其PCR和酶切結(jié)果如下圖所示，酶切序列（5'…A/ CCWGGT…3'/3'…TGGWCC/A…5'），經(jīng)分析，這個突變不是影響基因功能的突 變：

圖1　ITGB-5基因17號外顯子SEXA1酶切位點

2.3ITGB-5外顯子內(nèi)SNPs的卡方檢驗結(jié)果

采用卡方檢驗的方法對ITGB-5內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的9個SNPs進行分析，取顯著性閾值X2（5）0.05=11.07，X2（5）0.01= 15.09?？ǚ綑z驗結(jié)果如表4所示。

表4　對于ITGB-5內(nèi)各SNPs的卡方檢驗結(jié)果

由卡方檢驗結(jié)果可知：F4ac檢驗結(jié)果均不顯著，F(xiàn)4ab號外顯子的2個SNPs與黏附表型存在顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05），13號外顯子的1個SNP與F4ab黏附表型存在極顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.01）。但這些突變與腹瀉之間的關(guān)系，還需要進一步的基因功能驗證。

3　討論

3.1ITGB-5可能是導致黏附的候選基因

ITGB-5蛋白由α和β兩個亞基組成，這兩個亞基在宿主細胞表面表達，該蛋白是由整合素所編碼的，玻璃體蛋白Vn可以和整合素的β亞基結(jié)合，而大腸桿菌又可以和Vn結(jié)合，它們共同構(gòu)成復合體通過小腸上皮細胞侵入宿主細胞，形成包涵體的形式。在這個過程中，整合素發(fā)揮了重要的橋梁作用。

ITGB-5在細胞內(nèi)具有多重功能，該蛋白屬于跨膜蛋白家族成員，可以和RGD序列相結(jié)合。該序列是整合素蛋白所特有的序列，包含了一系列的氨基酸序列，整合素屬于跨膜受體，可以結(jié)合在RGD氨基酸的多肽當中。整合素介導了細胞分化，遷移，擴增，形態(tài)改變以及細胞死亡過程。與整合素結(jié)合的配體氨基酸包括Arg-Gly-Asp序列，這個序列可以通過整合素蛋白進行識別，而該蛋白是RGD依賴的蛋白，該整合素蛋白是B3整合素家族的成員。Maki ISHII等檢測了整合素家族的兩個成員在小鼠性腺細胞中的表達模式，并認為它們和該基因中的RGD序列有關(guān)，該研究檢測了ITGB-5在不同日齡，主要是10.5～13.5天內(nèi)的表達模式，結(jié)果表明該基因在性腺細胞中廣泛表達［4］。R.Pasqualini等研究了ITGB-5在不同組織中的表達模式，也證明了ITGB-5與器官發(fā)育，炎癥，組織修復以及細胞的穩(wěn)態(tài)維持有關(guān)，黏附過程是通過玻璃體蛋白以及纖維蛋白所介導的［5，6］。上述這些研究都說明了ITGB-5在細菌侵入細胞過程中的介導作用，但除此之外，ITGB-5還具有信號轉(zhuǎn)導等一系列功能。通過對該基因外顯子序列的測序分析發(fā)現(xiàn)了9個SNPs，其中5號外顯子內(nèi)的2個SNPs和13號外顯子內(nèi)的1個SNPs與黏附表型存在顯著關(guān)聯(lián)。

ITGB-5和MUC4具有相似的結(jié)構(gòu)、基因大小和功能，并在染色體上處于相近位置［7］。但對于它們的功能以及黏附表型與腹瀉關(guān)系的研究還停留在基本的統(tǒng)計分析階段，并不能真正的揭示其與腹瀉的關(guān)系。

圖5　Vn與整合素結(jié)合，侵染宿主細胞的過程

3.2與腹瀉有關(guān)的其他基因

黏液素家族成員（MUC4，MUC13，MUC20）等是細胞膜上表達的蛋白，Jorgensen等2003，2006年所發(fā)表的文章中認為MUC4是導致黏附以及腹瀉的重要候選基因，該基因7號內(nèi)含子中存在一個XbaI的酶切位點，通過RFLP，在相關(guān)群體中得到驗證，并在表型為黏附及非黏附的個體中進行關(guān)聯(lián)分析，該關(guān)聯(lián)分析可以得到基本吻合的結(jié)果［8］。該突變被認為是一個可能的分子標記并在2004年申請了專利。但MUC4本身屬于一個多能性基因，在消化道表面表達，形成黏液，該基因所表達的蛋白可以形成屏障，防止病原微生物侵入消化道。除此之外，該基因還具有多種功能，并與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)，在人類中，該基因的mRNA具有多個轉(zhuǎn)錄本。而黏液素家族的系列基因MUC13，MUC20等都具有類似功能。MUC4位于消化道和呼吸道的內(nèi)表面，一般由消化道和呼吸道內(nèi)表面的腺體所分泌，它可以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及維持細胞的生存。其結(jié)構(gòu)和生化組成可以為細胞表面提供保護并且使細胞處于穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境中，不僅如此，MUC4還可以防止細胞的癌變［9］。

對于MUC13和MUC20，國內(nèi)黃路生等對該基因cDNA序列內(nèi)所存在的突變進行了測序研究。并在MUC13 2 679 bp的cDNA序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)三個突變（c.576C＞T，c.908C＞G，c.935A＞C）。并且比較了豬和人該基因序列的差異，對于550 bp的cDNA進行了純化以及擴增的過程，并通過3'以及5'RACE，獲得該基因的全長以及基因內(nèi)部的各個功能元件。并通過UTRSCAN尋找該基因內(nèi)部的SNPs。通過RTPCR，檢測了該基因在不同組織中的表達情況，并且在黏附以及非黏附兩組個體中找到位于外顯子內(nèi)的多態(tài)（SNPs）以及進行傳遞不平衡研究（TDT）［10］。

對于MUC20，該研究小組也對該基因內(nèi)的多態(tài)進行了研究，研究方法與MUC20相似，通過擴增得到該基因全長的mRNA，在ORF處鑒別出兩個18 bp片段的缺失，該區(qū)段包含一個1 527 bp的開放閱讀框，并編碼532個氨基酸。RT-PCR分析表明，該基因在腎臟，前列腺，上皮以及膀胱中的表達量最高。SNP分析顯示，該基因內(nèi)存在7個多態(tài)，分別是內(nèi)含子5中g(shù).191C＞T，以及外顯子6中c.1 600C＞T，通過TDT分析可以得到這兩個多態(tài)與黏附表型之間存在顯著的關(guān)聯(lián)關(guān)系［11］。

4　結(jié)論

上述研究通過對ITGB-5基因外顯子的測序和突變分析，在基因的外顯子部分區(qū)段（外顯子5，6，7 和11，13，16和17）檢測得到突變，其中17號外顯子350 bp處存在SEXAI酶切位點。通過Snap-shot分型后發(fā)現(xiàn)3個SNPs與F4ab的黏附表型之間具有顯著關(guān)聯(lián)，但這些突變是否是與仔豬腹瀉相關(guān)的因果突變，還有待進一步試驗證實。從生物學功能上分析，ITGB-5很可能是影響?zhàn)じ降暮蜻x基因。本研究為從分子水平研究仔豬腹瀉的機制提供試驗依據(jù)。

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（編輯：晏兵兵）

中圖分類號：S828

文獻標識碼：B

文章編號：1006-799X（2016）06-0089-04

作者簡介：牛曉艷（1984-），女，山西太原人，助理研究員，主要從事海貍色獺兔育種工作。