腎上皮細(xì)胞損傷使草酸鈣晶體黏附增強(qiáng)的分子機(jī)制

甘瓊枝, 孫新園, 姚秀瓊, 歐陽(yáng)健明

(暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所, 廣州 510632)

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腎上皮細(xì)胞損傷使草酸鈣晶體黏附增強(qiáng)的分子機(jī)制

甘瓊枝, 孫新園, 姚秀瓊, 歐陽(yáng)健明

(暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所, 廣州 510632)

摘要研究了非洲綠猴腎上皮細(xì)胞(Vero)在損傷前后與一水合草酸鈣(COM)和二水合草酸鈣(COD)晶體的黏附作用及其引起的細(xì)胞反應(yīng), 探討了腎結(jié)石形成機(jī)理. COM和COD晶體與損傷細(xì)胞的黏附加重了細(xì)胞的過(guò)氧化損傷程度, 導(dǎo)致?lián)p傷細(xì)胞的活力進(jìn)一步降低, 乳酸脫氫酶(LDH)釋放量和活性氧(ROS)進(jìn)一步增加, 壞死細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多, 細(xì)胞體積縮小, 并出現(xiàn)凋亡小體. COM晶體對(duì)細(xì)胞的損傷能力顯著大于COD晶體. 掃描電子顯微鏡(SEM)觀測(cè)結(jié)果表明, 損傷組Vero與COM微晶的黏附作用顯著強(qiáng)于對(duì)照組, 且能促進(jìn)COM微晶的聚集. 共聚焦顯微鏡觀測(cè)結(jié)果表明, Vero損傷后, 其表面表達(dá)的晶體黏附分子透明質(zhì)酸(HA)顯著增加, HA分子是促進(jìn)微晶黏附的重要原因. 細(xì)胞表面草酸鈣的黏附量和晶體聚集程度與細(xì)胞的損傷程度成正相關(guān). 本文結(jié)果從分子和細(xì)胞水平上提示, 細(xì)胞損傷是導(dǎo)致草酸鈣腎結(jié)石形成的重要因素.

關(guān)鍵詞細(xì)胞調(diào)控; 生物礦化; 晶體黏附; 草酸鈣; 透明質(zhì)酸

腎結(jié)石的形成涉及由尿液過(guò)飽和所引起的礦物成核、 晶體生長(zhǎng)、 聚集及晶體與腎上皮細(xì)胞的黏附等過(guò)程[1]. 晶體在管腔的滯留是腎結(jié)石形成的先決條件. 計(jì)算結(jié)果表明, 體內(nèi)形成的微晶通過(guò)腎臟的時(shí)間為5～10 min, 而晶體通過(guò)的管道內(nèi)徑為15～60 μm[2], 由于晶體在尿液中的生長(zhǎng)速率為1～2 μm/min, 因此, 在5～10 min的時(shí)間內(nèi), 晶體不能生長(zhǎng)到足夠大來(lái)堵塞管道, 這些晶體很容易被管液沖刷掉. 即沒(méi)有黏附的晶體對(duì)腎結(jié)石形成的危險(xiǎn)性并不大.

晶體與腎上皮細(xì)胞的黏附是晶體滯留的一種重要方式[3]. 晶體只有在與腎上皮細(xì)胞黏附之后, 才有足夠的時(shí)間在細(xì)胞表面生長(zhǎng)或與其它晶體相互聚集, 形成大尺寸的晶體, 并最終導(dǎo)致腎結(jié)石的形成. 細(xì)胞損傷是發(fā)生黏附的首要條件[4].

正常人的腎小管上皮細(xì)胞具有完整的結(jié)構(gòu), 能很好地抵制晶體的黏附[5]. 但是, 當(dāng)細(xì)胞受到損傷后, 其表面會(huì)表達(dá)大量帶負(fù)電荷的分子, 如骨橋蛋白(OPN)、 透明質(zhì)酸(HA)和CD44等[6,7], 這些分子可以吸附Ca2+離子和黏附表面帶正電荷的草酸鈣晶體; 同時(shí), 被黏附的晶體還可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自由基, 通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)進(jìn)一步損傷腎上皮細(xì)胞[8], 從而增加腎結(jié)石形成的危險(xiǎn)性.

盡管尺寸為幾十微米的晶體與細(xì)胞的黏附早有報(bào)道[9,10], 但關(guān)于1 μm及以下尺寸的草酸鈣晶體與腎上皮細(xì)胞黏附作用的報(bào)道很少. 我們的前期研究[11,12]表明尿液中同時(shí)存在納米、 亞微米和微米尺寸的晶體.

微晶尺寸越小, 其比表面積就越大, 表面能也越大, 其與細(xì)胞特別是損傷細(xì)胞發(fā)生黏附作用的可能性就越大. 因此, 研究亞微米和納米尺寸的草酸鈣晶體, 特別是同時(shí)比較研究尿液中常見(jiàn)的、 但正常人與結(jié)石患者尿液中存在差異的一水合草酸鈣(COM)和二水合草酸鈣(COD)晶體與腎上皮細(xì)胞的作用差異, 可以從分子和細(xì)胞水平上了解尿石癥形成的機(jī)制, 為預(yù)防尿石癥的發(fā)生提供啟示.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

非洲綠猴腎上皮細(xì)胞(Vero)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù); 細(xì)胞增生分析試劑盒(CCK-8)購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所; 細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于日本Iwaki公司; 改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(Hyclone)購(gòu)于?？寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司; 青霉素和鏈霉素購(gòu)于北京普博生物技術(shù)有限公司; 30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過(guò)氧化氫(H2O2)、 氯化鈣和草酸鉀等常規(guī)試劑均為分析純?cè)噭? 生物素化的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(bHABP)購(gòu)于德國(guó)MERCK公司; 碘化丙啶(PI)、 蘇木素-伊紅(HE)染料、 活性氧檢測(cè)試劑盒[2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)]、 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液、 抗熒光猝滅封片劑和牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司; 異硫氰酸熒光素-親和素(FITC-Avidin)購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司.

X-L型環(huán)境掃描電子顯微鏡(SEM, 荷蘭Philips公司); LSM510 META DUO型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司); Safire2型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司); Gallios流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coalter公司); Optima 2000 DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES, 美國(guó)Perkin Elmer公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1COM和COD晶體的制備及晶體懸浮液的配制尺寸約1 μm的COM和COD晶體參照文獻(xiàn)[13]方法合成. 用無(wú)血清的培養(yǎng)基配制濃度為100 μg/mL的COM和COD懸浮液.

1.2.2非洲綠猴腎細(xì)胞株(Vero)的培養(yǎng)用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素、 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、 含5%CO2和飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Vero細(xì)胞, 采用胰蛋白酶消化法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代. 當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH=7.2～7.4)洗滌2次, 加入0.25%胰酶-乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)消化液1 mL, 于37 ℃培養(yǎng)箱中放置約3～5 min, 在倒置顯微鏡下觀察消化程度, 消化適度后, 加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化, 充分吹打分散細(xì)胞, 得到單細(xì)胞懸液.

1.2.3細(xì)胞損傷和檢測(cè)將Vero細(xì)胞按濃度為1.5×105Cell/mL、 100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中, 加入10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24 h. 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头譃?組: (A) 正常對(duì)照組: 吸除培養(yǎng)液, 用PBS洗滌細(xì)胞2次, 加入無(wú)血清培養(yǎng)液, 不加任何試劑; (B) 損傷對(duì)照組: 吸除培養(yǎng)液, 用PBS洗滌細(xì)胞2次, 分別加入0.3, 0.5, 1.0和2.0 mmol/L H2O2的無(wú)血清培養(yǎng)液損傷1 h; (C) 晶體處理組: 細(xì)胞分別經(jīng)各濃度的H2O2損傷1 h后, 吸除培養(yǎng)液, 用PBS洗滌2次后加入含100 μg/mL COM和COD的無(wú)血清培養(yǎng)液, 作用6 h. 達(dá)到孵育時(shí)間后, 按CCK-8試劑盒測(cè)試方法用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(OD)值, 并計(jì)算細(xì)胞活力.

1.2.4乳酸脫氫酶(LDH)釋放量檢測(cè)將Vero細(xì)胞按濃度為1.5×105Cell/mL、 100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中并孵育24 h. 在細(xì)胞同步化后, 將各培養(yǎng)孔按照上述方法分成3組. 達(dá)到作用時(shí)間后, 嚴(yán)格按照LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作, 在490 nm處測(cè)定吸光度.

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色觀察細(xì)胞形態(tài)將Vero細(xì)胞按濃度為1.5×105Cell/mL、 1 mL/孔接種于底部鋪有玻片的12孔培養(yǎng)板中, 加入10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24 h. 實(shí)驗(yàn)分組同上. 達(dá)到作用時(shí)間后吸除上清液, 用PBS洗滌2～3次后用多聚甲醛于室溫固定15 min, 再用PBS洗滌3次, 用蘇木素溶液染色15 min, 用純水將多余的蘇木素清洗掉后, 用伊紅染色液復(fù)染5 min; 多余的伊紅用純水清洗掉后, 在顯微鏡下觀察細(xì)胞形貌. 細(xì)胞核呈藍(lán)紫色, 而細(xì)胞漿呈粉紅色或紅色.

1.2.6碘化丙啶(PI)染色觀察將Vero細(xì)胞按濃度為1.5×105Cell/mL、 1 mL/孔接種于底部鋪有蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中, 加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24 h, 實(shí)驗(yàn)分組同上. 達(dá)到作用時(shí)間后吸除上清液, 將種好細(xì)胞的爬片用PBS洗滌2～3次, 然后加入5 μL碘化丙啶染色液, 混合均勻, 于4 ℃孵育20～30 min后在熒光顯微鏡下觀察. PI定量分析: 將細(xì)胞按濃度1.5×105Cell/mL、 100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中, 進(jìn)行上述操作后采用酶標(biāo)儀直接測(cè)定PI的熒光強(qiáng)度.

1.2.7活性氧(ROS)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分組同上. 達(dá)到培育時(shí)間后吸除上層清液, 將種好細(xì)胞的爬片用PBS清洗2～3次, 加入500 μL按照1∶1000體積比用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA, 于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min, 再用PBS清洗3次, 以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA, 12孔板中的細(xì)胞用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察, 96孔板中的細(xì)胞用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度.

1.2.8透明質(zhì)酸表達(dá)檢測(cè)將Vero細(xì)胞按濃度1.5×105cell/mL、 1 mL/孔接種于12孔培養(yǎng)板中, 待細(xì)胞同步化后, 將細(xì)胞分組, 分別加入COM或COD晶體. 孵育6 h后, 吸除上層清液, 用PBS洗滌細(xì)胞2次, 用固定液[5%(體積分?jǐn)?shù))冰醋酸+10%(體積分?jǐn)?shù))福爾馬林+70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇]固定細(xì)胞20 min, 然后用PBS洗滌細(xì)胞 3 次, 每次5 min, 再加入100 μL 5 μg/mL的bHABP溶液(配制在3%牛血清白蛋白溶液中, 現(xiàn)用現(xiàn)配), 于4 ℃下孵育過(guò)夜; 之后用PBS洗滌細(xì)胞 3 次, 每次5 min; 再加入100 μL 異硫氰酸熒光素-親和素孵育細(xì)胞1 h后, 用PBS洗滌3次, 每次5 min; 加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色液復(fù)染4 min, 用PBS洗滌3次, 每次5 min; 最后用抗猝滅劑封片, 于共聚焦顯微鏡下觀察, 細(xì)胞表面表達(dá)透明質(zhì)酸處為綠色, 細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色為藍(lán)色.

1.2.9COM和COD微晶與細(xì)胞黏附的SEM觀測(cè)細(xì)胞經(jīng)COM和COD懸浮液孵育6 h后, 吸除上層清液, 用PBS洗滌3次, 用2.5%戊二醛于4 ℃固定24 h后, 再用1%OsO4固定1 h, 用PBS洗滌3次, 梯度乙醇(30%, 50%, 70%, 90%和100%)脫水, 乙酸異戊酯置換多余乙醇后用CO2臨界干燥, 噴金包被后在X-L型環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察晶體黏附性.

1.2.10晶體黏附量的測(cè)定細(xì)胞種板密度及實(shí)驗(yàn)分組與HA檢測(cè)相同. 在4 ℃下細(xì)胞與晶體作用6 h后, 吸除上層清液, 取出玻片; 用PBS洗滌玻片3次, 洗去未黏附的晶體; 然后將洗好的玻片放置在25 mL燒杯中, 加入10 mL 濃HNO3和1.0 mL HClO4后, 在電爐上消化至溶液澄清, 再加熱蒸至近干時(shí)停止加熱, 利用余熱將溶液蒸干, 冷卻, 加入3 mL超純水, 混勻待測(cè), 同時(shí)準(zhǔn)備空白組(即10 mL 濃HNO3與1.0 mL HClO4的混合溶液), 利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)準(zhǔn)確測(cè)定鈣離子的濃度, 然后換算成草酸鈣晶體的黏附量.

2結(jié)果與討論

2.1COM與COD微晶的表征

2.2細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶釋放量變化

采用CCK-8法測(cè)定了經(jīng)不同濃度H2O2損傷后的Vero細(xì)胞活力及這些損傷細(xì)胞與COM和COD作用6 h后細(xì)胞活力的變化. 由圖2(A)可見(jiàn), 在c(H2O2)=0～2.0 mmol/L濃度范圍內(nèi), H2O2對(duì)Vero 的損傷呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性; COM對(duì)損傷細(xì)胞的再損傷作用明顯強(qiáng)于COD. 例如當(dāng)c(H2O2)=1.5 mmol/L時(shí), COD組的細(xì)胞活力與相應(yīng)損傷對(duì)照組的差值為8.1%, 而COM的差值為37.0%. 當(dāng)c(H2O2)=2.0 mmol/L時(shí), 由于細(xì)胞的損傷程度太大, 導(dǎo)致細(xì)胞活力均很小. 因此, 后面的實(shí)驗(yàn)只做到c(H2O2)=1.0 mmol/L. 隨著c(H2O2)增大, 細(xì)胞的LDH釋放量增加, 呈濃度依賴(lài)關(guān)系[圖2(B)], 且COM組的LDH釋放量顯著升高, 亦表明COM對(duì)細(xì)胞的損傷作用比COD大.

2.3不同損傷程度細(xì)胞的形貌觀察

為了觀察COM和COD晶體對(duì)受損Vero細(xì)胞的進(jìn)一步損傷, 采用蘇木素-伊紅(HE)染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)觀察細(xì)胞的整體形態(tài). 隨著H2O2濃度增大, 細(xì)胞受損程度明顯, 主要表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量的減少(圖3). 而經(jīng)COM和COD晶體處理后的細(xì)胞數(shù)目又明顯少于只經(jīng)過(guò)H2O2處理后的細(xì)胞. 晶體處理組細(xì)胞體積縮小, 嗜酸性染色增強(qiáng), 部分細(xì)胞核固縮成藍(lán)黑色, 并出現(xiàn)凋亡小體[14]. COM對(duì)受損Vero細(xì)胞的進(jìn)一步損傷更加嚴(yán)重, 特別是在0.5和1.0 mmol/L H2O2處理下, 細(xì)胞的形態(tài)明顯紊亂.

2.4碘化丙啶染色檢測(cè)細(xì)胞死亡率

PI是一種與細(xì)胞核內(nèi)DNA特異性結(jié)合的熒光染色劑, 在相同視野下, 被PI染紅的細(xì)胞核數(shù)目越多, 說(shuō)明死亡細(xì)胞的數(shù)目越多. 從圖4和圖5可以看出, 對(duì)于對(duì)照組, 被PI染紅的細(xì)胞核的數(shù)量和熒光強(qiáng)度隨著H2O2濃度的增加而增加, 說(shuō)明細(xì)胞的死亡數(shù)對(duì)H2O2的刺激具有濃度依賴(lài)性.

對(duì)于COM組, 被PI染紅的細(xì)胞核數(shù)量和熒光強(qiáng)度均比相應(yīng)對(duì)照組顯著增加(圖5); 相比之下, COD組的熒光強(qiáng)度只比相應(yīng)對(duì)照組稍微增加. 即在相同的細(xì)胞損傷程度下, COM晶體對(duì)Vero細(xì)胞的損傷作用大于COD晶體. 圖4中出現(xiàn)的紅點(diǎn)大小不一致的情況可能是由于凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核縮小, 核內(nèi)染色質(zhì)濃縮, 并出現(xiàn)凋亡小體, 因此觀察到的紅點(diǎn)變小; 而壞死細(xì)胞的體積增大, 細(xì)胞核腫脹, 觀察到的紅點(diǎn)較大. H2O2對(duì)Vero細(xì)胞的損傷屬于自由基損傷的一種. H2O2與細(xì)胞膜的類(lèi)脂質(zhì)結(jié)合形成過(guò)氧化脂質(zhì), 破壞胞內(nèi)組分及細(xì)胞膜系統(tǒng), 使多種胞內(nèi)酶[如乳酸脫氫酶LDH, 見(jiàn)圖2(B)]漏出到細(xì)胞間隙, H2O2還能與細(xì)胞內(nèi)大分子如核酸、 蛋白質(zhì)、 脂肪等共結(jié)合, 破壞細(xì)胞內(nèi)成分, 造成細(xì)胞死亡[8]. 文獻(xiàn)[15]用濃度分別為0.31, 0.63和1.25 mmol/L的H2O2損傷美國(guó)負(fù)鼠近端小管上皮細(xì)胞(OK) 30～60 min后, 細(xì)胞活力依次下降. Gonzalez等[16]使用濃度為0.5和3 mmol/L的H2O2損傷MDCK-II細(xì)胞60 min后, LDH的釋放量逐漸升高, 跨膜電阻(TER)逐漸降低.

2.5活性氧(ROS)檢測(cè)

ROS能夠迅速與細(xì)胞內(nèi)大分子反應(yīng), 導(dǎo)致正常細(xì)胞功能損害, 最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡, 這種氧化性的細(xì)胞損傷能夠促進(jìn)草酸鈣晶體在腎臟部位的沉積[17]. 選取DCFH-DA熒光探針觀測(cè)COM和COD晶體誘導(dǎo)Vero細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧變化(圖6). 相比于對(duì)照組細(xì)胞, H2O2, COM和COD晶體都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS. H2O2的濃度越大, 細(xì)胞內(nèi)ROS的綠色熒光強(qiáng)度越強(qiáng). 在加入晶體后, 細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng), 這表明COM和COD對(duì)受損細(xì)胞產(chǎn)生了進(jìn)一步的氧化性損傷, 且COM比COD引起了更多的ROS產(chǎn)生.

2.6細(xì)胞表面表達(dá)的透明質(zhì)酸檢測(cè)

圖7為不同損傷程度的Vero細(xì)胞與COM和COD黏附后的HA表達(dá)結(jié)果. 當(dāng)損傷細(xì)胞的H2O2濃度由0增加到0.3, 0.5和1.0 mmol/L時(shí), 黏附COD, COM后細(xì)胞的綠色熒光度依次增加, 表明細(xì)胞表面HA的表達(dá)增強(qiáng). 對(duì)于相同損傷程度的細(xì)胞, COM黏附組的綠色熒光總是比COD組強(qiáng), 說(shuō)明COM導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)的HA更多.

2.7細(xì)胞與晶體黏附的SEM觀察和黏附量測(cè)定

圖8和圖9為不同損傷程度的Vero細(xì)胞分別與COM和COD作用6 h后的SEM照片. 對(duì)于COM晶體, 隨著細(xì)胞的損傷程度增加, 不但黏附的晶體數(shù)量增加, 而且黏附晶體的聚集程度顯著增加[圖8(B)和(C)].

對(duì)于COD晶體, 雖然晶體的黏附量也隨著細(xì)胞的損傷程度增加而有所增加, 但增加的幅度明顯減小, 晶體的聚集程度也遠(yuǎn)比COM的小[圖9(B), (C)].

采用ICP檢測(cè)了不同損傷程度的Vero細(xì)胞對(duì)COM和COD黏附量的差異, 結(jié)果如圖10所示. 隨著細(xì)胞的損傷程度增加, COM和COD晶體的黏附量均逐漸增大, 且COM組的黏附量顯著大于COD組.

2.8細(xì)胞損傷后對(duì)草酸鈣晶體黏附增強(qiáng)的分子機(jī)制

受損的細(xì)胞表面會(huì)表達(dá)黏附分子. 從圖8和圖9可以看出, 腎上皮細(xì)胞損傷程度增加后, 其表面黏附的草酸鈣晶體量增加. 這是因?yàn)? 細(xì)胞損傷后不但導(dǎo)致了帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露在細(xì)胞表面[17,18], 而且還表達(dá)了多種晶體黏附分子如HA[19]、 OPN、 CD44、 膜聯(lián)蛋白II、 含唾液酸的糖蛋白和核仁素相關(guān)蛋白(NRP)[20]等. 這些分子均含有陰離子基團(tuán), 如NRP有一個(gè)高度酸化的區(qū)域, 62%的殘基含有天冬氨酸和谷氨酸[21]. 這些帶負(fù)電荷的分子不但可以通過(guò)靜電作用力與草酸鈣晶體結(jié)合, 而且可以通過(guò)氫鍵與草酸鈣中的草酸根(Ox2-)作用, 導(dǎo)致?lián)p傷細(xì)胞對(duì)晶體的滯留能力大大增強(qiáng), 從而增加了結(jié)石形成的危險(xiǎn).

AFM觀察結(jié)果也表明COM與損傷細(xì)胞基底膜的黏附力更大[22], 由對(duì)照組的(0.25±0.08) nN升高至(0.40±0.13) nN. 因低糖培養(yǎng)而受損的MDCK-I細(xì)胞對(duì)COM的黏附量比對(duì)照組提高了2.7倍[23]. 隨著細(xì)胞損傷程度的增加, 其表達(dá)的黏附分子會(huì)越來(lái)越多(圖7), 從而對(duì)晶體的黏附也會(huì)增強(qiáng)(圖8和圖9).

損傷使細(xì)胞膜破裂, 從細(xì)胞內(nèi)釋放出的有機(jī)物質(zhì)以及細(xì)胞膜碎片會(huì)促進(jìn)COM晶體的黏附、 聚集和生長(zhǎng). Chutipongtanate等[24]研究發(fā)現(xiàn)血紅細(xì)胞RBC細(xì)胞膜碎片能夠非常明顯地促進(jìn)COM晶體的生長(zhǎng)和聚集, 并比對(duì)照組在晶體尺寸和聚集體的數(shù)量方面分別增加約75%和2.5倍, 且約有50%的COM晶體被RBC細(xì)胞膜碎片黏附; 相比之下, RBC細(xì)胞膜碎片對(duì)COD晶體的生長(zhǎng)和聚集沒(méi)有影響.

2.9草酸鈣晶體與受損Vero細(xì)胞黏附能力的分析

損傷細(xì)胞對(duì)COM的黏附力比COD強(qiáng), 這提示當(dāng)體內(nèi)腎上皮細(xì)胞受到損傷時(shí), 會(huì)對(duì)尿液中COM晶體黏附增多, 并導(dǎo)致聚集和滯留在損傷部位, 因此, 尿液中生成更多的COM晶體比生成COD更會(huì)增大結(jié)石形成的危險(xiǎn)性.

3結(jié)論

隨著腎上皮細(xì)胞受損程度的增加, 其對(duì)COM和COD晶體的黏附量均增加, COM的聚集程度也增加. COM對(duì)細(xì)胞的損傷能力遠(yuǎn)大于COD. 細(xì)胞表面COM的黏附量和晶體聚集程度與細(xì)胞的損傷程度成正相關(guān). 腎上皮細(xì)胞損傷程度越大, 誘導(dǎo)結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)越大.

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(Ed.: F, K, M)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21371077).

Molecular Mechanism of Adhesion of Monohydrate and Dihydrate alcium Oxalate Crystals on Injured Kidney Epithelial Cells?

GAN Qiongzhi, SUN Xinyuan, YAO Xiuqiong, OUYANG Jianming*

(InstituteofBiomineralizationandLithiasisResearch,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

KeywordsCell-mediation; Biomineralization; Crystal adhesion; Calcium oxalate; Hyaluronic acid

AbstractEffects of cell injury on calcium oxalate monohydrate(COM) and calcium oxalate dihydrate(COD) microcrystalline adhesion and cellular response of calcium oxalate microcrystalline on African green monkey renal epithelial(Vero) cells after adhesion were evaluated. COM amd COD crystal adhesion to injured Vero cells increased oxidative damage degree, the LDH release amount, reactive oxygen species(ROS) and dead cells and decreased cell viability. The cells shrinked and apoptotic bodies appeared. COM crystals caused more serious damage to injured Vero cells than COD crystals. The results of scanning electron microscopy(SEM) showed that the adhesive capacity of injured Vero cells to COM was significantly stronger than the control group, which enhanced crystals adhesion and aggregation. Laser scanning confocal microscope showed that Vero cell injury increased the expression of crystal binding hyaluronic acid(HA) molecules which were the most important reasons for promoting microcrystalline adhesion. The microcrystalline adhesion and aggregation on cellular surface were positively correlated to cell injury degree. These findings indicated that cell injury was the leading risk factor of kidney stone formation, which may provide insights into the mechanisms of kidney stone formation from molecular and cellular levels.

收稿日期:2016-01-15. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-05-26.

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 21371077)資助.

中圖分類(lèi)號(hào)O614.23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 歐陽(yáng)健明, 男, 博士, 教授, 主要從事生物礦化和納米材料研究. E-mail: toyjm@jnu.edu.cn