吳晶晶　徐偉芳　王愛印　周 敏　黃濤楊　謝 潔

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶　400716)

B.methylotrophicusSWU6菌株產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化*

吳晶晶徐偉芳王愛印周 敏黃濤楊謝 潔

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶400716)

摘要前期從自然界土壤中分離篩選到一株纖維素酶產(chǎn)生菌Bacillus methylotrophicus SWU6菌株，為提高該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力，本研究采用3,5-二硝基水楊酸顯色法(DNS)對該菌株產(chǎn)酶所需碳源、氮源、溫度、pH值、裝瓶量、接種量等發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并比較優(yōu)化前后等量發(fā)酵上清液中CMCase酶活大小。結(jié)果表明：SWU6菌株產(chǎn)纖維素酶的最適碳源為淀粉，最適氮源為牛肉膏，最適培養(yǎng)溫度為50℃，培養(yǎng)基最適初始pH值為5.0，最適裝瓶量為20%，最適接種量為2%；在最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶條件下，SWU6菌株發(fā)酵上清液中的CMCase酶活達到454.69 U/mL，明顯高于優(yōu)化前利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵所產(chǎn)的CMCase酶活，且酶活提高約3倍。通過發(fā)酵條件優(yōu)化后，SWU6菌株單位體積發(fā)酵液顯示出了更強的纖維素酶活性。

關(guān)鍵詞甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌；纖維素酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中國是一個農(nóng)業(yè)發(fā)展大國,也是秸稈資源最為豐富的國家之一，每年產(chǎn)生農(nóng)作物秸稈總量達6.4億多噸，且有不斷上升趨勢[1]。農(nóng)作物秸稈中富含纖維素類可再生資源，深度開發(fā)秸稈不僅可以解決我國的能源危機，亦是科學(xué)發(fā)展的必然趨勢[2]。然而，由于纖維素難以被動物直接消化利用，目前對于秸稈農(nóng)作物的處理，人們通常還是采用直接就地焚燒的方式，這不僅造成可再生資源的浪費，同時造成環(huán)境污染[1]。為改變現(xiàn)狀，開發(fā)纖維素酶降解農(nóng)作物秸稈，實現(xiàn)廢棄資源的生物利用，已逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點之一[3]。

纖維素酶是指能降解纖維素產(chǎn)生葡萄糖的酶系總稱，包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及葡萄糖苷酶[4]，其來源十分廣泛，原生動物、微生物(細菌、真菌、放線菌等)都具有合成和分泌纖維素酶的能力[5]。目前，自然界中產(chǎn)纖維素酶的微生物主要為青霉、曲霉和木霉[6-8]，但利用這些微生物生產(chǎn)纖維素酶具有酶活低，成本高的特點[9]。因此，篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株，并優(yōu)化其產(chǎn)生纖維素酶的發(fā)酵條件，將有助于解決人類面臨的資源、環(huán)境、能源等問題[10-12]。

本研究是在前期篩選得到一株纖維素酶高產(chǎn)菌株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SWU6的基礎(chǔ)上[13]，通過測定該菌株發(fā)酵上清中內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)酶活大小，研究碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、初始 pH值、裝瓶量、接種量等單因素對其發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，優(yōu)化該菌株產(chǎn)生纖維素酶的最佳發(fā)酵條件[14]。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1樣品

前期研究篩選獲得的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SWU6菌株。

1.1.2培養(yǎng)基配方

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，酵母粉10.0g、CMC-Na 10.0g、NaCl 1.5g、KH2PO41.0g、pH 7.0，蒸餾水1 000mL，121℃滅菌20min。液體發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：蛋白胨10.0g、酵母粉10.0g、CMC-Na 10.0g、NaCl 1.5g、KH2PO41.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、pH 7.0，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20min。

1.1.3主要試劑配置方法

DNS試劑：6.3g 3, 5-二硝基水楊酸(DNS)、20.9g氫氧化鈉、182.0g酒石酸鉀鈉、5mL苯酚、5.0g無水亞硫酸鈉，定容至1 000mL，貯于棕色瓶中，放置一周后使用，使用之前需要過濾，需要特別注意藥品溶解溫度及加入順序[14]。

0.2M醋酸醋酸鈉緩沖液(pH4.8)：取40mL 0.2M醋酸和60mL的0.2M醋酸鈉(將2.721 8g醋酸鈉溶于95mL蒸餾水，定容至100mL)混勻即可[15]。

1.2實驗方法

1.2.1葡萄糖標準曲線繪制

參照文獻[13]所述的方法進行葡萄糖標準曲線的繪制。

1.2.2纖維素酶活性的測定

取一定量的發(fā)酵液倒入離心管中，4℃、8 000r/min離心10min，取上清液即為粗酶液。采用DNS法[16]進行酶活測定：用0.2M pH4.8的醋酸緩沖液配置1% CMC-Na溶液，取該底物溶液1mL，加入目的菌株發(fā)酵上清液1mL (對照管加入滅活的發(fā)酵上清液)，充分混勻后置于50℃水浴鍋中酶促反應(yīng)30min，隨后迅速加入DNS試劑3mL，沸水浴10min后，流水冷卻至室溫，加入去離子水定容至25mL。用對照管調(diào)零，在540nm測定吸光值，根據(jù)葡萄糖標準曲線，以三次平行測定平均值計算還原糖生成量。以每毫升發(fā)酵上清液酶促反應(yīng)30min釋放1μg葡萄糖的量為一個酶活單位(U)。

1.2.3發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.3.1碳源對SWU6菌株纖維素酶活的影響

分別選用羧甲基纖維素鈉、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖作為唯一碳源代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。取100mL三角瓶，均以30%裝瓶量裝入相應(yīng)培養(yǎng)基中(設(shè)置三個重復(fù))，接種3%種子液，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h[13]后，測定發(fā)酵上清液纖維素酶活。

1.2.3.2氮源對SWU6菌株纖維素酶活的影響

分別選用蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏、硝酸鉀、草酸銨作為唯一氮源代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源。取100mL三角瓶，均以30%裝瓶量裝入相應(yīng)培養(yǎng)基中(設(shè)置三個重復(fù))，接種3%種子液，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h后，測定發(fā)酵上清液纖維素酶活。

1.2.3.3培養(yǎng)溫度對SWU6菌株纖維素酶活的影響

取100mL三角瓶，以裝瓶量30%裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，接種3%種子液，分別置于20℃、25℃、28℃、30℃、32℃ 、37℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃和53℃，共計12個溫度處理(設(shè)置三個重復(fù))，180r/min下振蕩培養(yǎng)24h后，測定發(fā)酵上清液纖維素酶活。

1.2.3.4初始pH對SWU6菌株纖維素酶活的影響

取100mL三角瓶，以裝瓶量30%裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，各設(shè)置3個重復(fù)，并接入3%種子液，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h，測定發(fā)酵上清液纖維素酶活。

1.2.3.5裝瓶量對SWU6菌株纖維素酶活的影響

取100mL三角瓶，分別按10%、20%、30%、40%的裝瓶量裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(設(shè)置三個重復(fù))，接種3%種子液，28℃，180r/min下振蕩培養(yǎng)24h，測定發(fā)酵上清液纖維素酶活。

1.2.3.6接種量對SWU6菌株纖維素酶活的影響

取100mL三角瓶，以裝瓶量30%裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接入SWU6菌株的種子液(設(shè)置三個重復(fù))，28℃，180r/min下振蕩培養(yǎng)24h后，測定發(fā)酵上清液纖維素酶活。

1.2.3.7優(yōu)化驗證

利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組分與發(fā)酵條件對菌株SWU6進行發(fā)酵培養(yǎng)，并進行發(fā)酵上清液纖維素酶活性(CMCase酶活)測定，重復(fù)三次，取平均值。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵上清液纖維素酶活性與優(yōu)化發(fā)酵條件后的發(fā)酵上清液纖維素酶活性進行比較。

2結(jié)果與分析

2.1纖維素酶活性的測定

根據(jù)葡萄糖標準曲線計算回歸方程為：y=0.646 8x+0.044 4，R2=0.986 8。

2.2SWU6產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1碳源對SWU6菌株CMCase酶活的影響

將SWU6菌株在含不同碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液CMCase活力。由圖1可得，SWU6菌株在7種不同碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)纖維素酶活力依次是淀粉>麥芽糖>蔗糖>果糖>乳糖>果糖>羧甲基纖維素鈉>無碳源，碳源為淀粉時，酶活最強，最高酶活力215.10U/mL。

2.2.2氮源對SWU6菌株CMCase酶活活性的影響

將SWU6菌株在不同氮源培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液CMCase活力。由圖2可得，SWU6菌株在7種不同氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)纖維素酶活力依次是牛肉膏>蛋白胨>硝酸鉀>硫酸銨>硝酸銨>無氮源>草酸銨>尿素，牛肉膏為氮源時，酶活最強，最高酶活力為116.20U/mL。

圖1　SWU6菌株不同碳源

圖2　SWU6菌株不同氮源

2.2.3培養(yǎng)溫度對SWU6菌株CMCase酶活活性的影響

將SWU6菌株在不同溫度下進行培養(yǎng)(圖3)：在20-50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，發(fā)酵上清中的纖維素酶活整體呈現(xiàn)上升趨勢；培養(yǎng)溫度為50℃時，酶活最高，最高酶活力為352.60U/mL；當培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，發(fā)酵上清中的纖維素酶活顯著下降，故SWU6菌株的最適培養(yǎng)溫度為50℃。

圖3　培養(yǎng)溫度對SWU6菌株發(fā)酵上清液纖維素酶活的影響

2.2.4初始pH對SWU6菌株CMCase酶活活性的影響

將SWU6菌株在不同起始pH下進行培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液CMCase活力。由圖4可得，SWU6菌株在6種不同pH下進行發(fā)酵的產(chǎn)纖維素酶活力依次是pH 5.0>pH 5.5>pH 6.0>pH 7.5>pH 7.0>pH 6.5>pH 8.0>pH 8.5，起始pH為5.0時，酶活最高，最高酶活力為174.19U/mL。因此，SWU6菌株的最適起始pH為5.0。

圖4　SWU6菌株不同起始pH

圖5　SWU6菌株不同裝瓶量

2.2.5不同裝瓶量對SWU6菌株CMCase酶活活性的影響

將SWU6菌株在不同體積的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液CMCase活力。由圖5可得，SWU6菌株在4種體積發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵的產(chǎn)纖維素酶活力依次是20%>10%>40%>30%，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為20%時，酶活最高，最高酶活力為194.67U/mL。因此，SWU6菌株的最適裝瓶量為20%。

2.2.6不同接種量對SWU6菌株CMCase酶活活性的影響

將SWU6菌株在接種不同體積種子液的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液CMCase活力。由圖6可得，SWU6菌株在5種接種量不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵的產(chǎn)CMCase活力依次是2%>1%>3%>4%>5%，接種量為2%時，酶活最高，最高酶活力為177.21U/mL。因此，SWU6菌株的最適接種量為2%。

綜上所述，最適發(fā)酵條件培養(yǎng)基的碳源為可溶性淀粉，氮源為牛肉膏，培養(yǎng)溫度為50℃，起始pH值為5.0，裝瓶量為20%，接種量為2%。

2.3優(yōu)化驗證實驗

在最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)酶條件下， SWU6菌株發(fā)酵上清液中纖維素酶酶活大小為454.69U/mL，SWU菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵上清液的纖維素酶酶活大小為115.55U/mL，優(yōu)化后發(fā)酵上清液纖維素酶酶活比原發(fā)酵培養(yǎng)基提高339.14U/mL，約提高3倍(圖7)。

圖6　SWU6菌株不同接種量

圖7　優(yōu)化后菌株SWU6菌株和

3討論

對于微生物發(fā)酵過程而言，無論它的目的產(chǎn)物是酶或其它微生物代謝產(chǎn)物，還是菌體本身，都與微生物所處的環(huán)境密切相關(guān)，其中最重要的是發(fā)酵培養(yǎng)基組份和培養(yǎng)條件，它們對發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量有非常重要的影響。因此對其發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化是提高產(chǎn)酶的重要方法之一[17]。本研究以纖維素酶產(chǎn)生菌株SWU6菌株為目的菌株，對纖維素酶產(chǎn)生菌株SWU6菌株發(fā)酵培養(yǎng)基進行了碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、起始pH、裝瓶量、接種量等6個方面進行了培養(yǎng)基組分和發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化，獲得了該菌株產(chǎn)酶的較優(yōu)條件。后續(xù)研究將通過正交實驗進一步優(yōu)化該菌株的產(chǎn)酶條件，為富含纖維素的秸稈、蠶沙等生物質(zhì)的降解提供待選菌株。

參考文獻

[1]韓魯佳, 閆巧娟, 劉向陽, 等. 中國農(nóng)作物秸稈資源極其利用現(xiàn)狀[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2002,18(3)：87-91.

[2]李素波. 纖維素酶高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D]. 蘭州: 蘭州大學(xué)，2008.

[3]柴明艷. 一株高產(chǎn)纖維素酶菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014,53(13)：3141-3144.

[4]劉燕，張宏福，孫哲. 纖維素酶的分子生物學(xué)與基因工程研究進展[J]. 飼料工業(yè)，2007，28(18)：11-14.

[5]李爭明，張娟，鄧中洋，等. 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)通報，2015，31(5)：146-152.

[6]楊麗娜. 一株產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[D]. 陜西: 西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[7]REESE E T，MANDELS M. Stability of the cellulase of Trichoderma reesei under use conditions[J]. Biotechnology and bioengineering，1980，2(2)：323-335.

[8]曲音波，高培基，王祖農(nóng). 斜臥青霉纖維素酶系的酶學(xué)研究[J]. 微生物學(xué)報，1988，28(2)：121-130.

[9]CHRISTIAN P, KUBICEK. The cellulase proteins ofTrichodermareesei：structure，multiplicity，mode of action and regulation of formation[M] // Enzymes and Products from Bacteria Fungi and Plant Cells. American: Springer Berlin Heidelberg，1992：1-27.

[10]姜紹通，吳綿長，楊培周，等. 纖維素酶產(chǎn)生菌的誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 生物工程(食品科學(xué))，2011，32(11)：192-197.

[11]MAYA JACOB JOHN，SABU THOMAS. Biofibres and biocomposites[J]. Carbohydrate Polymers，2008，71：343-364.

[12]PIERO VENTURI，GIANPIETRO VENTURI. Analysis of energy comparison for crops in European agricultural systems[J]. Biomass and Bioenergy，2003，25：235-255.

[13]吳晶晶，王愛印，周敏，等. 一株纖維素酶產(chǎn)生菌SWU6菌株的篩選鑒定[J]. 蠶學(xué)通訊，2014，125：7-13.

[14]李爭明，盧凡. 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶學(xué)特性研究[D]. 武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2014.

[15]方心芳. 應(yīng)用微生物學(xué)實驗法[M]. 中國輕工業(yè)出版社. 1993年01月第1版.

[16]MILLER G L. Use of dinitionsalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analylical Chemistry，1959，31(3)：426-428.

[17]樂文民. 中性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件初步優(yōu)化[D]. 無錫：江南大學(xué)，2014.

In a preliminary study, the strainBacillusmethylotrophicusSWU6 was screened and identified, which is a cellulase-producing bacterium. In order to improve its capacity of enzyme production, the present research optimized the amount of carbon and nitrogen, temperature, pH, bottling amount and inoculation amount by the 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetric method (DNS), and the CMCase activity in the supernatant before optimization and after optimization was compared. The result showed that optimum carbon source, nitrogen source, fermentation time, initial temperature and pH of the medium, media amount and inoculation amount for enzyme production of this strain were starch, beef extract, 24 hours, 50℃ and 5.0, 20% and 2%, respectively. After optimization, the CMCase activity of the strain reached 454.69 U/mL, which was three times higher than it was before optimization. And higher cellulase activity was exhibited in the same volume of fermentation broth of the strain SWU6 after fermentation optimization.

Key wordsBacillusmethylotrophicus; Cellulase; Fermentation condiition; Optimization

The Optimization of Fermentation Conditions for SWU6-a Strain of the Cellulase-Producing BacteriumBacillusmethylotrophicus

WU Jing-jingXU Wei-fangWANG Ai-yin ZHOU MinHUANG Tao-yangXIE Jie

(CollegeofBiotechnology,SouthwestUniversity，Chongqing400716,China)

ABSTRACT

通訊作者：謝潔，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。Email：healthjie@163.com

資助項目：西南大學(xué)本科生科技創(chuàng)新基金項目(No.1331002)。