田吉騰， 侯 丫， 2， 劉志鴻， 楊愛國， 吳 彪， 周麗青， 董春光， 2（. 農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室， 中國水產科學研究院 黃海水產研究所， 山東 青島26607； 2. 上海海洋大學 水產與生命學院， 上海 20306）

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基于線粒體COI基因的毛蚶群體遺傳多樣性

田吉騰1， 侯 丫1， 2， 劉志鴻1， 楊愛國1， 吳 彪1， 周麗青1， 董春光1， 2
（1. 農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室， 中國水產科學研究院 黃海水產研究所， 山東 青島266071； 2. 上海海洋大學 水產與生命學院， 上海 201306）

采用PCR 技術， 擴增了大連、乳山、煙臺、舟山4個毛蚶（Scapharca subcrenata）地理群體共38個個體的線粒體COI 基因部分序列， 并分析了4個毛蚶群體的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關系。研究結果顯示： 38個毛蚶COI部分序列經處理得到長度均為625bp的基因片段， 共分為30種單倍型； 基于COI部分序列的分析結果， 毛蚶4個地理群體總的變異位點為301個， 多樣性指數(shù)Pi為0.15048， 平均核苷酸差異數(shù)為92.242， 單倍型多樣性指數(shù)S為241。聚類分析顯示毛蚶大連群體、乳山群體和煙臺群體具有高度的遺傳多樣性， 3個群體交叉聚在一起， 沒有明顯的群體分化； 舟山群體單獨聚為一支， 與其他3個群體分化明顯。研究表明， 線粒體COI 基因不能單獨做為毛蚶大連、乳山和煙臺群體的遺傳標記， 但可以作為毛蚶舟山群體的有效群體遺傳標記， 為線粒體COI基因在群體遺傳學的應用提供了基礎資料。

毛蚶（Scapharca subcrenata）； COI 基因； 群體； 遺傳多樣性

［Foundation ： National Basic Research Special Foundation of China （2013FY110700）； Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes， Yellow Sea Fisheries Research Institutes （20603022013032）］

毛蚶（Scapharca subcrenata）， 俗稱瓦楞子或毛蛤，屬軟體動物門（Mollusca）， 雙殼綱（Bivalvia）， 翼形亞綱（Pteriomorphia）， 蚶目（Arcoida）， 蚶科（Arcidae），毛蚶屬（Scapharca）， 廣泛分布于中國、朝鮮和日本沿海［1］， 在中國的渤海、黃海、東海、南海均有大量分布， 是中國北方重要經濟貝類之一。毛蚶普遍生活在低潮線以下， 至水深幾十米的海域， 喜歡棲息于軟泥質底或泥沙質底［2-3］。20世紀60～70年代， 毛蚶資源豐富， 曾為主要的捕撈對象之一。但由于捕撈強度過大， 毛蚶資源遭到了嚴重的破壞， 資源衰退。近年來， 毛蚶的增養(yǎng)殖工作以及各方面的研究已經引起人們的重視［4］。迄今人們對于毛蚶的研究， 主要集中在親貝的促熟、苗種的培育和養(yǎng)成技術， 以及生理生化、生態(tài)習性、餌料需求等方面［4-7］， 分子遺傳多樣性方面未見報道。

群體遺傳多樣性水平與生物的生長速度、抗病能力和物種的進化速度有重要的關系。近年來， 線粒體基因組的研究在一定程度上促進了群體遺傳學的發(fā)展，并且實現(xiàn)了從分子水平上對自然群體的保護［8］。線粒體中的COI基因， 即線粒體細胞色素C 氧化酶亞基Ⅰ， 作為一種分子標記， 具有多種優(yōu)勢： （1）COI基因在物種進化中屬于中度變異， 其進化速率一般大于ITS-1的進化速率， 能夠從DNA分子水平上成功的區(qū)分物種。（2）COI基因的引物通用性比較強， 可操作性強。（3）COI基因密碼子的第3個位點存在更多的堿基置換， 并且長度約為650bp， 能夠表現(xiàn)出足夠物種的的差異和變化， 同時也剛好適宜進行擴增和后期檢測。

在海洋貝類中， 線粒體COI基因也廣泛用于分析群體的遺傳多樣性， 如對文蛤［9］， 光滑河藍蛤［10］，泥蚶［11］， 縊蟶［12］等研究表明， COI基因可以用于分析物種的群體內和群體間的遺傳距離， 分析個體差異，從而推斷群體的遺傳分化水平及基因交流的可能性。本實驗通過測定毛蚶群體的線粒體的COI基因部分序列， 進行遺傳分析， 構建系統(tǒng)進化樹， 旨在分析毛蚶遺傳多樣性水平和不同地理群體的系統(tǒng)進化關系， 并推測線粒體COI基因能否作為區(qū)分毛蚶不同群體的有效分子標記， 同時為毛蚶的資源保護及群體遺傳學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的4個毛蚶地理群體樣品分別取自遼寧大連旅順（2013年6月1日）， 山東乳山白沙灘（2013年4月2日）， 山東煙臺芝罘島（2013年4月1日）， 浙江舟山普陀（2013年4月18日）近海， 樣品是活體加冰運輸， 迅速解剖， 取出閉殼肌部分， 置于–80℃超低溫冰箱保存。

1.2 基因組DNA提取和PCR擴增

每個群體隨機選取9～10個樣品， 采用常規(guī)的酚氯仿法提取基因組DNA［13］， 最終得到的DNA模板稀釋至100ng/μL。使用COI通用引物（F： GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G； R： TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA［14］）進行毛蚶4個群體COI基因片段的擴增。PCR采用Easy Taq DNA聚合酶進行擴增， PCR反應在Eppendorf PCR儀上進行。反應體系為30μL， 包括3μL PCR緩沖液（Mg2+plus）， 4μL 高純度的脫氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/L）， 10μmol/L的正反方向引物各2μL，1μL Taq酶（5 U/μL）， 2μL DNA模板（80 ng/μL），16μL滅菌水。PCR反應程序為： 94℃預變性5min；（94℃： 20s， 52℃： 50s， 72℃： 1min； ）30個循環(huán)， 最后72℃延伸10 min。所得PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后利用美國UVP凝膠成像系統(tǒng)進行觀察拍照。

1.3 測序和數(shù)據(jù)處理

將瓊脂糖凝膠電泳檢測結果中條帶較單一的PCR擴增產物樣品送于北京華大基因生物有限公司進行PCR產物純化測序。所得的結果進行NCBI BLAST比對驗證同源性， 保證測序結果的可靠性。利用DnaSP 5軟件［15］分析毛蚶群體單倍型數(shù)（Number of Haplotype， H）、平均核苷酸差異（Average number of nucleotide difference， K）及核苷酸多樣性指數(shù)（Nucleotide diversity， Pi）等遺傳多樣性參數(shù)， 運用MEGA 5.0軟件［16］對序列的堿基組成（Nucleotide composition）、多態(tài)位點（Number of polymorphic sites， S）、變異位點（Variable sites）進行分析， 采用NJ（Neighbor-joining）法構建毛蚶4個地理群體的系統(tǒng)發(fā)育樹， Bootstrap置信值設為1000。

2 結果與分析

2.1 序列的堿基組成

測序后獲得的COI基因片段長度不一， 經序列對準去除序列兩端部分堿基后， 得到38條長度均為625 bp的COI基因片段。4個群體毛蚶COI基因部分片段的堿基組成（表1）， A+T含量普遍高于G+C含量， 這與Medina等的研究一致［17］。大連、乳山、煙臺3個群體COI序列堿基組成相差不大， 而舟山群體盡管在A+T含量上與其他3個群體相近， 但其堿基A的含量比其他3個群體低19.9%， T的含量高16.7%。說明舟山群體在遺傳系統(tǒng)分化上可能占有較為特殊的地位。

表1 毛蚶不同群體COI基因部分序列的堿基組成Tab. 1 Base compositions of COI gene partial sequences of four populations of S. subcrenata

2.2 遺傳多樣性分析

毛蚶群體COI基因片段遺傳多樣性指數(shù)（表2），大連、乳山和煙臺群體序列之間差異不大， 多態(tài)位點分別占總數(shù)的28.8%， 35.0%和28.0%， 多樣性豐富。乳山群體的平均核苷酸差異指數(shù)最高， 為106.58。舟山群體9個個體的COI基因部分序列中僅有2個多態(tài)位點， 群體特征明顯， 群體遺傳分化很小， 平均核苷酸差異指數(shù)最低， 僅為0.44。

由于大連群體中DL1和煙臺群體中YT7單倍型是相同的， 因此本文研究的38個毛蚶個體中共存在30個單倍型， GenBank序列號為KP253046-KP253075，對應的個體依次為DL（2、3、4、6、7、8）， RS（6、5、8、10）， YT（5、8、9、10）， ZS（2、1、5、6）， YT（1、2、3、4）， RS（3、4、1、2）， DL（5、9）， RS（9、7）。30個單倍型的核苷酸多態(tài)位點見表3。

2.3 遺傳距離

根據(jù)4種毛蚶群體COI基因部分序列計算的群體內和群體間的遺傳距離如表4所示。乳山群體內遺傳距離最大， 為0.21， 舟山群體內遺傳距離最小，為0.0011。群體間遺傳分析表明， 毛蚶舟山群體和大連群體間的遺傳距離最大， 為0.26， 煙臺群體和大連群體之間遺傳距離最小， 為0.15。

表2 毛蚶不同群體COI基因片段的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 2 The genetic diversity parameters of COI gene partial sequences in different populations of S. subcrenata

2.4 分子系統(tǒng)進化樹的構建

根據(jù)4種毛蚶群體COI基因部分序列建立的系統(tǒng)進化樹（圖1）?？梢钥闯觯?舟山群體首先單獨聚在一起， 乳山群體、煙臺群體和大連群體則相互交叉聚合在一起， 沒有明顯的先聚在一起的情況。

3 討論

3.1 毛蚶4個群體的遺傳多樣性

本實驗中毛蚶群體的多態(tài)位點較多， 核苷酸多樣性指數(shù)較高， 可能的原因分以下兩種： （1）選取樣品的時候要先調查其來源， 距離較近的物種可能受到外來物種的污染或人為因素的干擾， 如群體中的個體經過捕撈作業(yè)和商戶之間的轉手買賣可能群體之間的交叉所致。（2）煙臺和乳山地理位置較近， 在遺傳分化上不明顯， 兩群體和大連群體均與黃海相鄰， 地理群體之間可能存在一定的基因交流。

李旭光等［18］對毛蚶江蘇海州灣群體、浙江象山港群體和遼寧遼東灣群體的同工酶遺傳多樣性進行了研究， 發(fā)現(xiàn)毛蚶群體具有較為豐富的遺傳多樣性，這與本文的研究結果相一致。毛蚶大連、煙臺和乳山群體均具有較高的遺傳變異水平， 這說明毛蚶對環(huán)境的適應能力很強， 也是毛蚶能夠在中國沿海地區(qū)廣泛分布的原因之一［19］。王曉梅等［20］對毛蚶3個群體核糖體ITS區(qū)進行了RFLP分析， 發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性最低的為寧波樣本， 而寧波群體和舟山群體距離很近， 存在一定的基因流， 從而與本實驗中舟山群體遺傳多樣性的研究結果一致。

王曉梅等［20］發(fā)現(xiàn)毛蚶ITS區(qū)限制性片段長度多態(tài)性很低， ITS區(qū)564 bp的序列中多態(tài)位點僅為3.37%， 與本研究中高多態(tài)性的結果不一致， 原因是在線粒體基因組中， 不同基因的進化速率并不相同，而COI基因的進化速率一般大于ITS-1的進化速率，因此所得出的結論并不矛盾。

3.2 群體間的遺傳進化關系

陳蓉［1］等采用形態(tài)性狀多變量分析方法， 對中國5個野生毛蚶群體進行了分析， 發(fā)現(xiàn)在形態(tài)學方面， 毛蚶天津塘沽和山東青島群體最為接近， 廣西北海群體與其他群體差異最大。形態(tài)最為一致說明具有較近的進化關系， 與本研究結果中山東青島與遼寧大連群體遺傳關系相近的結果基本一致。

王曉梅等［20］構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中顯示毛蚶大連群體和塘沽群體沒有明顯的群體分化， 寧波群體單獨聚為一支。李旭光等人［18］的聚類分析中， 江蘇海州灣群體首先與寧波象山港群體相聚， 后與遼東灣群體聚類。系統(tǒng)發(fā)育關系均表明環(huán)渤海灣的群體遺傳距離較近， 和東海海岸附近的群體遺傳關系較遠。

3.3 COI基因作為群體之間遺傳進化關系標記的討論

本研究分析表明， 線粒體COI基因的進化速度相對適中， 不僅對相近的物種進行識別鑒定， 也可以對具有地理隔離的群體進行分類鑒定。

4 結論

基于COI基因片段的研究結果表明， 中國北部的毛蚶群體如煙臺、大連、乳山群體具有較高的遺傳多樣性， 群體內差異大， 群體間差異不大。而舟山群體遺傳多樣性較低， 群體內遺傳差異很小， 與北方群體具有較大的遺傳距離。

表3 毛蚶4個地理群體30個單倍型的核苷酸多態(tài)位點Tab. 3 Nucleotide polymorphism in four geographical populations of 30 haplotypes of S. subcrenata

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

表4 毛蚶4個群體內和群體間的遺傳距離Tab. 4 The genetic distance within and between different populations of S. subcrenata

圖1 基于毛蚶4個群體COI部分序列建立的系統(tǒng)發(fā)育關系Fig. 1 Phylogenetic relationships among four groups of S. subcrenata based on COI gene partial sequences

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（本文編輯： 梁德海）

Genetic diversity of different populations of Scapharca subcrenata based on mitochondrial COI gene

TIAN Ji-teng1， HOU Ya1， 2， LIU Zhi-hong1， YANG Ai-guo1， WU Biao1， ZHOU Li-qing1，DONG Chun-guang1， 2
（1. Key Laboratory of sustainable development of marine fisheries， Ministry of agriculture， the Yellow Sea Institute of fisheries， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China； 2. College of Fisheries and Life Sciences， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

May， 9， 2015

Scapharca subcrenata； COI gene； population； diversity

General PCR technology was used for the amplification of mitochondrial COI gene partial sequences of four groups of Scapharca subcrenata （Dalian， Rushan， Yantai， and Zhoushan）. A total of 38 sequences from different populations were determined and analyzed. The results are as follows： （a） After excluding both sides of the inaccurate sequences， 38 COI gene partial sequences of S. subcrenata， 625 bp each， were eventually identified， among which 30 haploid types were detected. （b） Based on partial COI gene sequence analysis of the four groups of S. subcrenata， the total variation loci， haploid type diversity index S， nucleotide diversity index Pi， and average nucleotide difference index were 301， 241， 0.15048， and 92.242， respectively. （c） Cluster analysis showed that ark shells from three groups， Rushan， Dalian， and Yantai， had a high degree of genetic diversity， and they clustered across， without the obvious characteristics of the groups. However， ark shells from the Zhoushan group gathered themselves together， apart from the other three groups obviously. The genetic diversity index of Zhoushan group was much lower than that of other groups. （d） Mitochondrial COI gene could not separate the ark shells from Rushan， Dalian， and Yantai but can be a marker for Zhoushan populations of S. subcrenata， which provides more basic data for the application of mitochondrial COI gene in population genetics.

S917.4

A

1000-3096（2016）01-0001-09

10.11759/hykx20140429002

2015-05-09；

2015-09-10

國家科技部基礎工作專項 （2013FY110700） ； 黃海水產研究所級基本科研業(yè)務費資助（20603022013032）

田吉騰（1986-）， 男， 助理研究員， 主要從事海洋生物種質資源與遺傳育種的研究， E-mail： 0708jixiang@163.com； 劉志鴻（1972-），通信作者， 女， 研究員， E-mail： liuzh@ysfri.ac.cn， 電話： 0532-85836340