鄧　超，任改艷，孫阿寧，羅曉平，王崢濤，竇　薇

(上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海　201203)

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豆蔻明對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

鄧超，任改艷，孫阿寧，羅曉平，王崢濤，竇薇

(上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203)

摘要：目的探討豆蔻明(cardamonin，CDN)對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)/MyD88/NF-κB/iNOS信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。方法利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)處理RAW264.7細(xì)胞建立炎性細(xì)胞模型并分組：正常對(duì)照組(Vehicle組)、模型組(LPS組)和藥物處理組(LPS+CDN組)；CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活力，Griess法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)型NO合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-ɑ、白介素(interleukin，IL)-1β和IL-6的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)iNOS、TLR4、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、核因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)phosphorylated(p)-p65、inhibitor κBα(IκBα)和p-IκBα的蛋白表達(dá)。結(jié)果1～50 μmol·L-1豆蔻明對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒有毒性，但可以劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的NO分泌和iNOS、COX-2、MCP-1、TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表達(dá)，25 μmol·L-1豆蔻明可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的iNOS、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達(dá)及抑制IκBα降解。結(jié)論豆蔻明通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS信號(hào)通路從而抑制NO的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：RAW264.7細(xì)胞；TLR4；MyD88；NF-κB；iNOS；豆蔻明

Toll樣受體4(toll-1ike receptor 4，TLR4)是介導(dǎo)天然免疫的一類重要的跨膜蛋白受體，與宿主細(xì)胞對(duì)各種微生物致病原的識(shí)別有關(guān)[1]。TLR4能特異性地識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，通過(guò)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將病原相關(guān)分子刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)，使核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抑制單位IκBα(inhibitor of κBα)發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB與IκBα解離進(jìn)入細(xì)胞核，與下游基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中的κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終引起炎癥因子大量釋放和炎癥反應(yīng)[2]。

豆蔻明(cardamonin，CDN)，結(jié)構(gòu)為2′, 4′-二羥基-6′-甲氧基查爾酮，主要存在于姜科植物草豆蔻(AlpiniakatsumadaiHayata)的種子中[3]。豆蔻明具有抗血小板聚集、抗腫瘤、抗誘變、抗炎、抗氧化和抗菌等多種生物活性[4]。大量研究表明，豆蔻明對(duì)炎癥介質(zhì)前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-ɑ、白介素(interleukin，IL)-1β和IL-6的抑制作用與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[5]。TLR4是NF-κB的上游調(diào)控基因，有關(guān)豆蔻明對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用僅見于我們前期的研究報(bào)道:豆蔻明對(duì)小鼠結(jié)腸黏膜炎性損傷的保護(hù)作用，可能與下調(diào)結(jié)腸組織的TLR4表達(dá)、抑制NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)活性和減少炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)[6]。本研究擬以LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞作為模型，進(jìn)一步探討豆蔻明對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，為豆蔻明的抗炎分子機(jī)制研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

豆蔻明(C16H14O4, MW 270.28)購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限公司(純度≥98%，批號(hào)P0242)；RAW264.7小鼠單核/巨噬細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所；DMEM、胎牛血清、TRIzol、DMSO和Tween-20購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司；LPS購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)購(gòu)于上海前塵生物科技有限公司；Griess試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail)和RIPA裂解液購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；iNOS、TLR4、MyD88、IκBα、p-p65、P-IκBα和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；ECL顯影試劑盒購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及化學(xué)品處理RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用 DMSO 溶解豆蔻明，配成0.1 mol·L-1儲(chǔ)液，-20℃避光保存。使用前取出融化，漩渦振蕩后按一定濃度加入到細(xì)胞，使加入細(xì)胞的DMSO終濃度為0.1%?？瞻?溶劑對(duì)照組DMSO濃度為0.1%。

1.2.2細(xì)胞活力檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞懸液按照1×105每孔接種于96孔板，每組4個(gè)復(fù)孔。除溶劑對(duì)照孔外，其余每孔用CDN(0、1、5、15、25、50 μmol·L-1)預(yù)處理2 h，然后加入LPS(2 mg·L-1)共同孵育12 h和24 h。去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入10 μL試劑盒自帶CCK-8溶液，37℃孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A=450 nm)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，細(xì)胞存活率/%=給藥組/溶劑對(duì)照組×100%。

1.2.3NO的測(cè)定采用Griess試劑法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總NO的含量。RAW264.7細(xì)胞懸液按照1×105每孔接種96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔。除溶劑對(duì)照孔外，其余每孔用CDN(0、1、5、15、25、50 μmol·L-1)預(yù)處理2 h，然后加入LPS(2 mg·L-1)共同孵育24 h。按照Griess試劑盒操作步驟檢測(cè)上清NO的含量。

1.2.4RT-PCRRAW264.7細(xì)胞懸液按照2×106每孔接種6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。除溶劑對(duì)照孔外，其余每孔用CDN(0、5、15、25 μmol·L-1)預(yù)處理2 h，然后加入LPS(2 mg·L-1)共同孵育24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用TRIzol試劑提取總RNA并定量。按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green PCR試劑，在ABI 7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min預(yù)變性，95 ℃ 5s變性，60 ℃ 34 s退火，共40個(gè)循環(huán)。按照標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(Tab 1)。每次擴(kuò)增設(shè)置β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照，用PCR儀自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，得出Ct值，統(tǒng)計(jì)△△Ct值以比較各組mRNA的表達(dá)。

Tab 1　The primer sequence for RT-PCR

2結(jié)果

2.1CDN 對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

如Fig 1所示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)CDN(0～50 μmol·L-1)預(yù)處理2 h，然后加入LPS(2 mg·L-1)共同孵育12 h和24 h后，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，細(xì)胞活力差異無(wú)顯著性(P>0.05)。提示本研究所用CDN濃度劑量(0～50 μmol·L-1)及處理時(shí)間(12、24 h)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。

2.2CDN抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NO分泌

如Fig 2所示，與正常對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清中NO含量明顯升高(P<0.01)，CDN(0～50 μmol·L-1)可劑量依賴性抑制NO的產(chǎn)生，其中25 和50 μmol·L-1CDN明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清液中NO的積累(P<0.01)。

Fig 1　Effects of CDN on cell viability of RAW264.7 cells(n=4)

Fig 2　Effects of CDN on production of

##P<0.01vsvehicle-treated cells;**P<0.01vsLPS-treated cells

2.3CDN下調(diào)RAW264.7細(xì)胞炎癥介質(zhì)mRNA的表達(dá)

正常對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞中環(huán)氧合酶-2(COX-2)、誘導(dǎo)型NO合成酶(iNOS)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平都很低，LPS刺激后表達(dá)量均明顯升高(P<0.01)，CDN(5、15、25 μmol·L-1)可劑量依賴性抑制上述基因的表達(dá)(Fig 3)。

2.4CDN抑制RAW264.7細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS通路蛋白的表達(dá)

Western blot顯示(Fig 4)，CDN(25 μmol·L-1)可明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4(P<0.01)、MyD88(P<0.01)、p-p65(P<0.01)、p-IκBα(P<0.05)和iNOS蛋白的表達(dá)(P<0.05)，抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα蛋白的降解(P<0.01)。

Fig 3　Effects of CDN on mRNA

##P<0.01vsvehicle-treated cells;*P<0.05,**P<0.01vsLPS-treated cells

3討論

LPS誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞模型，被廣泛用于研究炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生的過(guò)量NO會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和組織壞死[7]。NO由iNOS催化合成，NO還可促進(jìn)炎癥介質(zhì)前列腺素E2(PGE2)合成的限速酶COX-2的生成[8]。本研究表明，豆蔻明可劑量依賴性抑制RAW264.7細(xì)胞NO的產(chǎn)生，同時(shí)抑制iNOS、COX-2 mRNA的表達(dá)及iNOS蛋白的表達(dá)。據(jù)報(bào)道炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和化學(xué)因子MCP-1主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，是早期炎癥的標(biāo)志物，在機(jī)體損傷、感染、免疫反應(yīng)等情況下大量合成和釋放，是炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑[2]。本研究發(fā)現(xiàn)豆蔻明可劑量依賴性抑制RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1 mRNA表達(dá)。

NF-κB是啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下NF-κB以非活性的NF-κB/IκBα復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到LPS刺激后，IκBα發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB與IκBα解離后轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，參與調(diào)節(jié)各種炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidas，MPO)、NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等[2，6]。目前已發(fā)現(xiàn)多種因素可以誘導(dǎo)NF-κB活化，包括細(xì)胞因子、LPS、蛋白激酶C和理化因素(X射線、氧化劑及化療藥物)等[9]。本研究發(fā)現(xiàn)豆蔻明可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞p-p65和p-IκBα的表達(dá)及IκBα的降解，提示豆蔻明對(duì)NF-κB活性具有抑制作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4-5]。

迄今人類TLRs家族成員至少已發(fā)現(xiàn)10種，TLR4是TLRs家族的一個(gè)重要亞型，在人體多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等[10]。TLR4的配體包括細(xì)菌脂多糖LPS、硫酸乙酰肝素、纖連蛋白-EDA、透明質(zhì)酸和纖維蛋白原等，受損組織和壞死細(xì)胞也可以釋放出TLR4的內(nèi)源性激活物[2]。RAW264.7細(xì)胞表面具有TLR4病原模式識(shí)別受體,能識(shí)別外源性同源配體LPS，刺激信號(hào)通過(guò)TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)至RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)基因的表達(dá)。MyD88屬于銜接蛋白家族成員，TLR4一旦被激活，可募集胞內(nèi)段的銜接蛋白MyD88觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)，激活NF-κB[6]。本研究發(fā)現(xiàn)豆蔻明可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4和MyD88蛋白表達(dá)，提示豆蔻明可能通過(guò)下調(diào)RAW264.7細(xì)胞TLR4的蛋白表達(dá)，抑制其銜接蛋白分子MyD88，進(jìn)而抑制NF-κB活化和iNOS蛋白表達(dá)，最終抑制NO的產(chǎn)生。

Fig 4　Effects of CDN on signaling molecules expression of TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS pathway in LPS-stimulated RAW264.7 cells(n=4)

A:Western blot was performed and one representative experiment from three independent experiments was shown;B:Blots were quantified by densitometric analysis.##P<0.01vsvehicle-treated cells;*P<0.05,**P<0.01vsLPS-treated cells.

綜上所述，豆蔻明通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS信號(hào)通路，進(jìn)而抑制炎性介質(zhì)NO的生成，從而減輕炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究應(yīng)探討其他的炎癥信號(hào)通路。

(致謝：本文所有實(shí)驗(yàn)均在上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所藥理實(shí)驗(yàn)室完成，鄧超、任改艷、孫阿寧和羅曉平負(fù)責(zé)細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)，任改艷負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，王崢濤和竇薇負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫。)

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The regulatory effect of cardamonin on TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS pathway

DENG Chao, REN Gai-yan , SUN A-ning, LUO Xiao-ping, WANG Zheng-tao, DOU Wei

(TheMOEKeyLaboratoryforStandardizationofChineseMedicineandShanghaiKeyLaboratoryofComplexPrescription,InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTCM,Shanghai201203,China)

Abstract:AimTo assess the regulatory effects of cardamonin(CDN) on toll-like receptor(TLR)-4/MyD88/NF-κB/iNOS signaling pathway in lipopolysaccharide(LPS)-stimulated RAW264.7 macrophage cells.MethodsLPS-stimulated RAW264.7 cells were divided into three groups: vehicle-treated group, LPS-treated group and LPS+CDN-treated group. Cell viability was assessed by CCK-8 assay. The concentration of nitric oxide(NO) in cell culture medium was measured by Griess reagent. The mRNA levels of iNOS, COX-2, MCP-1,TNF-α, IL-6 and IL-1β were determined by reverse transcription real-time quantitative PCR(RT-qPCR). The protein levels of inducible nitric oxide synthase(iNOS), TLR4, myeloid differentiation factor 88(MyD88), nuclear factor κB(NF-κB) phosphorylated(p)-p65, inhibitor κBα(IκBα), and p-IκBα were determined by Western blot. Results1～50 μmol·L-1CDN had no cytotoxicity in RAW264.7 cells. However, CDN inhibited the LPS-induced secretion of nitric oxide(NO) and mRNA expressions of iNOS, COX-2, MCP-1,TNF-α, IL-6 and IL-1β in a dose-dependent manner. Moreover, 50 μmol·L-1CDN inhibited the LPS-induced up-regulation of iNOS, TLR4, MyD88, NF-κB p-p65, p-IκBα and down-regulation of IκBα. ConclusionCardamonin inhibits the production of NO via a mechanism associated with the inhibition of TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS pathway.

Key words:RAW264.7 cell; TLR4; MyD88; NF-κB; iNOS; cardamonin

收稿日期:2016-01-14,修回日期:2016-03-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81273572)；上海市高校一流學(xué)科創(chuàng)新研究基金資助項(xiàng)目(No ZYX-CXYJ-023).

作者簡(jiǎn)介：鄧超(1990-)，男，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail:1004596075@qq.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.009

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0779-05

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R284.1；R329.25；R364.5；R392.11； R392.12；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.018.html

竇薇(1969-)，女，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：vivi.dou@yahoo.com