李峰杰,張金艷,何　萍,李貽奎,趙　樂,郝　偉,李連達(dá)

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院李連達(dá)院士研究室，北京　100091)

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組織自發(fā)熒光在大鼠心肌缺血實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

李峰杰,張金艷,何萍,李貽奎,趙樂,郝偉,李連達(dá)

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院李連達(dá)院士研究室，北京100091)

摘要：目的基于特定的熒光檢測技術(shù)，探討組織自發(fā)熒光在大鼠心肌缺血性損傷實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。方法本研究通過Kodak FX Pro活體成像技術(shù)檢測大鼠心肌組織的自發(fā)熒光。通過熒光檢測，比較正常大鼠和心肌缺血性損傷大鼠的心肌組織對應(yīng)部位自發(fā)熒光的變化，并進(jìn)行定量分析。結(jié)果心肌缺血損傷后，損傷部位組織自發(fā)熒光信號明顯增強(qiáng)，將熒光信號通過活體成像系統(tǒng)進(jìn)行定量，與正常心肌組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論大鼠心肌組織在心肌缺血損傷后，心肌組織的自發(fā)熒光明顯增強(qiáng)，為大鼠心肌缺血損傷模型的研究及其評價(jià)提供新的方法。有利于定位、定性、定量比較研究，可用于病理、生理、藥理及作用機(jī)制等多方面研究。

關(guān)鍵詞：大鼠；心肌組織；心肌缺血損傷；N-BT；自發(fā)熒光；活體成像系統(tǒng)；定量分析

心肌梗死是危害人類健康的心血管疾病之一。在疾病研究中，動(dòng)物模型被廣泛用于發(fā)病機(jī)制和藥物治療研究，模型的有效建立是完成相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的前提，對研究急、慢性心肌梗死的病理過程、診斷及治療均有重要意義[1]。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備心肌缺血模型，是目前應(yīng)用比較廣泛的心肌缺血模型的研究方法。在該模型的定量評價(jià)指標(biāo)中，主要以心肌梗死面積測定為主。需要做心肌組織切片，采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(N-BT)染色顯示梗死的心肌組織，拍照，運(yùn)用相關(guān)軟件計(jì)算每片心肌組織的梗死面積[2]。

這種方法有其局限性：首先，心肌組織的染色程度不好控制，缺乏嚴(yán)格的操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。染色過輕或者過重，都會(huì)導(dǎo)致明顯區(qū)分梗死區(qū)與非梗死區(qū)的困難，難以準(zhǔn)確定量；其次，在實(shí)驗(yàn)研究中，心肌組織不僅只用于梗死范圍的測定，還需要進(jìn)行諸如組織病理學(xué)研究、蛋白及RNA水平等多指標(biāo)的研究。但是一旦心肌組織經(jīng)過染色后，就很難再用于其它方面的實(shí)驗(yàn)研究。在這種情況下，只能將部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織用于心肌梗死面積測定，另外的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織用于其它方面實(shí)驗(yàn)研究。這就導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的浪費(fèi)，以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組內(nèi)誤差的產(chǎn)生。不利于多指標(biāo)、多時(shí)間點(diǎn)的多方面同步研究。

組織會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光現(xiàn)象，眾多學(xué)者應(yīng)用組織自發(fā)熒光進(jìn)行相關(guān)研究[2-7]。田樹紅等[2]利用Caliper Kinetics IVIS 活體成像系統(tǒng)檢測大鼠的組織自發(fā)熒光，用于大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的定量分析。KodakIn-vivoImaging System FX Pro多功能小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)也能檢測到較微弱的組織自發(fā)熒光，而且能夠?qū)晒鈴?qiáng)度進(jìn)行定量分析。本研究運(yùn)用該系統(tǒng)展示出正常大鼠與心肌缺血損傷大鼠心肌組織的自發(fā)熒光情況，更為精確的計(jì)算出心肌組織的梗死面積，為大鼠心肌缺血模型的研究及其評價(jià)提供定位、定量、多指標(biāo)觀察提供新方法、新依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

Wistar大鼠，清潔級，30只，體質(zhì)量為240～280 g，♂。購于北京華阜康科技股份有限公司。大鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院普通動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(京)2009-0001，溫度21℃～26℃，相對濕度40%～70%，10/14 h明暗交替照明。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料及飲用水

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。生活飲用水，經(jīng)MN-LM 100J型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水處理器生產(chǎn)，符合《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。飲水瓶放于飲水瓶專用位置，自由飲水。

1.3大鼠心肌缺血模型的制備

將12只大鼠隨機(jī)分為2組，正常組和模型組，每組6只。對模型組大鼠采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制作急性心肌缺血模型。大鼠以10 mL·kg-1腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，仰臥固定于大鼠板上。在大鼠左側(cè)第4、5肋間切口，打開胸腔，撕開心包，輕壓胸廓擠出心臟，用0號手術(shù)線于左心耳下2mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，立即將心臟放回胸腔，關(guān)閉切口，縫合皮膚。

1.4大鼠心肌組織的熒光檢測

造模后48 h，立即取出心臟，用生理鹽水沖洗心腔殘留的血液，用濾紙吸干多余液體后，采用KodakIn-vivoImaging System FX Pro小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測。將準(zhǔn)備好的心肌組織放入快速成像系統(tǒng)內(nèi)合適的位置，然后進(jìn)行拍照、數(shù)據(jù)分析和保存。先對心肌組織進(jìn)行完整分析；然后再自結(jié)扎線以下平行于冠狀溝均勻地將心室部分橫斷切成5片(正常組大鼠于相同位置進(jìn)行切片)，進(jìn)行局部分析，以確定損傷的部位和損傷的程度。

1.5大鼠心肌組織N-BT染色和組織自發(fā)熒光檢測的比較

將正常大鼠和模型大鼠的心臟切片，先用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測，然后再進(jìn)行N-BT染色。對利用快速成像系統(tǒng)得到的自發(fā)熒光檢測數(shù)據(jù)和N-BT染色得到結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.6組織自發(fā)熒光定量分析

采用KodakIn-vivoImaging System FX Pro小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.7統(tǒng)計(jì)方法

2結(jié)果

2.1大鼠心肌組織NBT染色與組織自發(fā)熒光檢測的比較

分別將6只正常大鼠和6只心肌缺血損傷大鼠對其心肌組織進(jìn)行心臟切片，先用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測，然后再對心臟組織切片進(jìn)行N-BT染色。

參照活體成像系統(tǒng)色標(biāo)，從 Fig 1可以看出，正常組的自發(fā)熒光顯示藍(lán)色和綠色，模型組大部分區(qū)域顯示藍(lán)色和綠色，某些部位自發(fā)熒光顯示黃色和紅色；并且，模型組自發(fā)熒光圖中顯示紅色和黃色的區(qū)域(圖中紅色箭頭所示)，與N-BT染色圖中顯示心肌缺血的相對部位(圖中紅色箭頭所示)基本吻合。紅色區(qū)域與壞死心肌組織部位對應(yīng)，黃色區(qū)域與缺血心肌組織部位對應(yīng)，而藍(lán)色和綠色區(qū)域則與正常心肌組織部位對應(yīng)。通過組織自發(fā)熒光與N-BT染色比較，組織自發(fā)熒光可以很直觀顯示出組織的心肌缺血部位和損傷程度，且心肌組織的自發(fā)熒光強(qiáng)度和心肌組織的損傷程度直接相關(guān)；同時(shí)，針對N-BT染色中顯示不是很清楚的缺血部位(圖中綠色箭頭所示)，通過自發(fā)熒光檢測，也可以很清楚的顯示出(自發(fā)組織熒光圖中綠色箭頭所示)。

2.2大鼠心肌組織自發(fā)熒光檢測

采用小動(dòng)物活體成像的熒光檢測技術(shù)對心肌缺血心肌組織進(jìn)行熒光檢測(圖示左側(cè)為正常組，右側(cè)為模型組)。通過Fig 2可以看出，正常組大鼠心肌組織自發(fā)熒光強(qiáng)度較低，顯示綠色和藍(lán)色，表示正常組大鼠心肌組織均處于正常狀態(tài)；模型組大鼠心肌組織部分部位自發(fā)熒光強(qiáng)度較高，有紅色和黃色區(qū)域出現(xiàn)，表示模型組大鼠心肌組織部分部位均出現(xiàn)了壞死和缺血。

2.3組織自發(fā)熒光強(qiáng)度定量分析

通過 Kodak FX Pro活體成像系統(tǒng)對整個(gè)心肌組織或者是感興趣部位的自發(fā)熒光強(qiáng)度(Sum Intensity)進(jìn)行定量分析，所得到的數(shù)據(jù)再通過SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，比較正常心肌組織和模型組損傷心肌組織的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

如 Tab 1 所示，與正常組比較，模型組心肌組織紅色區(qū)域(壞死部位)、黃色區(qū)域(缺血部位)及整個(gè)區(qū)域自發(fā)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；兩組綠色和藍(lán)色區(qū)域沒有明顯差異。結(jié)果表明，心肌缺血損傷大鼠心肌組織出現(xiàn)了明顯的缺血和壞死現(xiàn)象，且與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4N-BT染色法與組織自發(fā)熒光法心肌梗死面積定量分析

用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)分別對N-BT法與組織自發(fā)熒光法心肌組織圖片，進(jìn)行每片心肌雙側(cè)梗死區(qū)面積與整片心肌總面積測定，計(jì)算每片心肌梗死區(qū)面積占整片心肌總面積的百分比。所得到的數(shù)據(jù)再通過SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，比較兩種方法下正常組與模型組心肌梗死面積占心肌總面積的比例及模型組心肌梗死面積占心肌總面積的比例差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)。

Tab 2所示，與正常組比較，N-BT法和組織自發(fā)熒光法模型組心肌梗死面積明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但是，與N-BT法比較，組織自發(fā)熒光法模型組心肌梗死面積沒有明顯變化。結(jié)果表明，兩種方法均能準(zhǔn)確測定心肌梗死面積。

3討論

心肌缺血模型的造模方法主要以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈法為主[8]，其中檢測心肌梗死范圍主要采用定量組織學(xué)N-BT染色法[9-12]。雖然這種方法技術(shù)比較成熟，但對于心肌梗死的評價(jià)方法還有待完善和創(chuàng)新。本研究首次提出用組織自發(fā)熒光來評價(jià)心肌缺血損傷的心肌組織。

Fig 1　NBT staining of rat myocardial tissue with spontaneous fluorescence detection

Note: A-1, A-2 represent the N-BT staining of the positive and negative side of normal myocardium；B-1, B-2 represent the tissue spontaneous fluorescence of the positive and negative side of normal myocardium；C-1, C-2 represent the N-BT staining of the positive and negative side of injury myocardium；D-1, D-2 represent the tissue spontaneous fluorescence of the positive and negative side of injury myocardium.

Tab 1　Data analysis of myocardial tissue autofluorescence for normal control group and myocardial ischemia±s，n=6)

**P<0.01，*P<0.05vsnormal control group

The tissue spontaneous fluorescence of positive side of normal and injury myocardium . Left side normal，right side injury.

The tissue spontaneous fluorescence of negative side of normal and injury myocardium . Left side normal，right side injury.

Fig 2Autofluorescence of ischemia injury of myocardial tissue by KodakIn-vivoImaging System FX Pro

GroupTheproportionofmyocardialinfarctionareatothetotalareaN-BTTissuespontaneousfluorescenceNormal0.0000±0.00000.0020±0.0039Ischemia0.0692±0.0222**0.0669±0.0190**

**P<0.01vsnormal control group

我們通過研究發(fā)現(xiàn)，對傳統(tǒng)檢測指標(biāo)心肌梗死面積，兩種方法沒有明顯差異，均能顯示模型組與正常組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對組織自發(fā)熒光，模型組心肌缺血損傷部位的組織自發(fā)熒光強(qiáng)度與正常心肌組織相比明顯增強(qiáng)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與N-BT染色比較，自發(fā)組織熒光檢測具有很多優(yōu)點(diǎn)：首先，自發(fā)組織熒光檢測可以更加明顯、直觀地反映缺血心肌組織的缺血部位及程度。即使N-BT染色不是很清楚的顯示缺血區(qū)域，自發(fā)組織熒光也可以很清楚的顯示出來；其次，心肌組織不進(jìn)行N-BT染色，可以保證心肌組織的完好性，可以繼續(xù)用于其他方面的研究；再者，同一動(dòng)物的心肌組織能同時(shí)進(jìn)行應(yīng)用自發(fā)組織熒光進(jìn)行心肌缺血測定，以及其他方面的實(shí)驗(yàn)研究，可以有效消除利用不同動(dòng)物進(jìn)行不同方面實(shí)驗(yàn)帶來的組間差異，使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更為精準(zhǔn)，更為可信。

但是，應(yīng)用組織自發(fā)熒光檢測心肌缺血損傷研究，也有其局限性。這種方法對儀器的要求較高。因?yàn)榻M織的自發(fā)熒光本身就比較微弱，所以必須是能夠檢測到較微弱熒光的精密儀器。目前，全世界范圍內(nèi)比較認(rèn)可的小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)主要有3種，分別是精諾真小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)、柯達(dá)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)、GE小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)。每種儀器的售價(jià)均在百萬人民幣以上。因此，并不是所有實(shí)驗(yàn)室都有條件能夠開展此項(xiàng)研究。

本次實(shí)驗(yàn)，我們采取的是在心肌缺血造模后48h進(jìn)行的組織自發(fā)熒光檢測。在造模成功的48h后，無論是N-BT染色，還是組織自發(fā)熒光檢測，心肌缺血及其導(dǎo)致的壞死都已經(jīng)比較明顯。如果在心肌缺血后不同時(shí)間點(diǎn)利用傳統(tǒng)N-BT染色與用組織自發(fā)熒光進(jìn)行對比觀察，以進(jìn)一步了解兩種方法的特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)，可以選擇性用于心肌缺血的研究。

基于本次實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果以及上述假設(shè)，本課題組接下來將進(jìn)一步研究在心肌缺血后急性、亞急性及慢性損傷不同時(shí)間內(nèi)，利用活體成像系統(tǒng)對心肌組織的自發(fā)熒光進(jìn)行檢測，以觀察在心肌缺血后不同時(shí)間內(nèi)N-BT染色和組織自發(fā)熒光變化的連續(xù)動(dòng)態(tài)過程及兩種方法的優(yōu)劣。為組織自發(fā)熒光在心肌缺血損傷中的應(yīng)用進(jìn)一步開拓思路。

(本文實(shí)驗(yàn)是在中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心功能室進(jìn)行的，非常感謝孫明杰研究員、孫麗華助理研究員的指導(dǎo)和幫助！)

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Application of tissue spontaneous fluorescence in myocardial ischemia injury of rats

LI Feng-jie，ZHANG Jin-yan，HE Ping，LI Yi-kui，ZHAO Le，HAO Wei，LI Lian-da

(TheAcademicianResearchLaboratoryofLiLianda,XiyuanHospitalCACMS，Beijing100091，China)

Abstract:AimTo discuss the application of tissue spontaneous fluorescence in myocardial ischemia injury of rats based on specific fluorescence detection technology.MethodsThe change of spontaneous fluorescence was compared between the myocardial tissue of normal rats and those of rats with myocardial ischemia injury and an quantitative analysis was then made.ResultThe results showed that spontaneous fluorescence of myocardial tissue for myocardial ischemia injury changed significantly.Spontaneous fluorescence signal of injury considerably was enhanced.The fluorescence signal which was quantified by FX Pro had statistical significance compared with normal myocardial tissue，P<0.01 orP<0.05.ConclusionOur research shows that spontaneous fluorescence of myocardial tissue can be enhanced obviously after myocardial ischemia injury．Our research provides a method for the research and evaluation of myocardial ischemia injury model in rats which can be used in positioning，qualitative and quantitative comparative study and in pathological，physiological，pharmacological and mechanism study.

Key words:rat；myocardial tissue；myocardial ischemia injury；N-BT；autofluorescence；invivoimaging system；quantitative analysis

收稿日期:2016-01-18,修回日期:2016-03-15

基金項(xiàng)目：北京自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 7162167)

作者簡介：李峰杰(1985-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥理，E-mail:lfj1210@126.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.028

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0885-04

中國圖書分類號：R-332；R322.11；R446.8；R542.22

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.056.html

李連達(dá)(1934-)，男，中國工程院院士，中國中醫(yī)科學(xué)院首席研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:lilianda1934@163.com