熊靜悅 李孝容 鄢良春 趙軍寧

[摘要]基于費(fèi)氏弧菌CS234的Microtox微毒測試體系優(yōu)化與方法學(xué)考察，為該方法更加可靠地應(yīng)用于中藥注射劑綜合急性毒性的測試打下基礎(chǔ)。采用PlackettBurman法優(yōu)化設(shè)計(jì)影響費(fèi)氏弧菌發(fā)光的因素，建立以七水硫酸鋅為標(biāo)準(zhǔn)毒物和質(zhì)量控制樣品的反應(yīng)體系，得到最優(yōu)發(fā)光條件為：費(fèi)氏弧菌凍干粉平衡15 min后加入復(fù)蘇液1 mL，混勻10 min，取100 μL菌液測試初始發(fā)光度，隨后立即加入1 mL復(fù)蘇液或待測樣品，反應(yīng)10 min后再次測試相應(yīng)發(fā)光強(qiáng)度，上述操作均在（15±1）℃條件下完成；復(fù)蘇稀釋液、滲透壓調(diào)節(jié)液及七水硫酸鋅儲(chǔ)備液不干擾費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的測定，該方法特異性良好；質(zhì)量控制樣品、定量下限樣品批內(nèi)精密度<5%，批間精密度<10%，準(zhǔn)確度在858%～1032%。七水硫酸鋅溶液在386～7727 mg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2178lnx-1514，R2=0998。該方法下ZnSO4·7H2O對(duì)費(fèi)氏弧菌的IC50為1990 mg·L-1；對(duì)七水硫酸鋅儲(chǔ)備液及其質(zhì)量控制樣品分別連續(xù)考察120，8 h，其RSD<2%，提示其在室溫及4 ℃保存條件下穩(wěn)定性良好；pH 45～80時(shí)，費(fèi)氏弧菌發(fā)光的波動(dòng)控制在±10%，該pH可滿足絕大多數(shù)中藥注射劑的測試需要。針對(duì)費(fèi)氏弧菌CS234建立的微毒測試體系進(jìn)行優(yōu)化后，具有良好的特異性、穩(wěn)定性、靈敏度、準(zhǔn)確度及適應(yīng)性，提示可應(yīng)用于中藥注射劑綜合急性毒性的測試。

[關(guān)鍵詞]中藥注射劑；微毒測試；急性毒性；費(fèi)氏弧菌CS234

[Abstract]Vibrio fischeri CS234 was used to establish and optimize microtox assay system， laying a foundation for the application of this method in comprehensive acute toxicity test of traditional Chinese medicine （TCM） injections Firstly， the PlackettBurman method was carried out to optimize the factors which would affect Vibrio fischeri CS234 luminescence Secondly， ZnSO4·7H2O was chosen as reference substance to establish its reaction system with quality control samples The optimal luminescence conditions were achieved as follows： ①At a temperature of （15±1） ℃， Vibrio fischeri CS234 lyophilized powders were balanced for 15 min， then， 1 mL resuscitation fluid was added and blended for 10 min 100 μL bacteria suspension was taken to measure the initial luminescence intensity， and then 1 mL resuscitation fluid or test sample was immediately added；after reaction for 10 min， corresponding luminescence intensity was measured again Resuscitation diluent， osmotic pressure regulator and ZnSO4·7H2O stock solution showed no interference to the determination of Vibrio fischeri CS234 luminescence intensity， so this method was of good specificity The withinand betweenbatch precisions of quality controls and the lower limit of quantification （LLOQ） samples were <5% and <10% respectively， while the accuracy ranged between 858% and 1032% The standard curve equation of ZnSO4·7H2O ranged from 386 mg·L-1 to 7722 mg·L-1 （final concentrations） was y=2178lnx-1514， R2=0998； meanwhile， IC50 of ZnSO4·7H2O to Vibrio fischeri CS234 was 1990 mg·L-1 ZnSO4·7H2O stock solution and its quality controls were continuously investigated for 120 h and 8 h respectively， and their RSD was lower than 2%， indicating stability at room temperature and 4 ℃ storage conditions Between pH 4580， luminescence intensity of Vibrio fischeri CS234 was controlled within ±10%， and such pH value range could meet the testing needs of the vast majority of traditional Chinese medicine injections The Vibrio fischeri strain CS234 assay system was specific， stable， sensitive， accurate and adaptable after optimization， so it was suitable for the comprehensive acute toxicity assessment of TCM injections

[Key words]traditional Chinese medicine injection； microtox assay； acute toxicity； Vibrio fischeri CS234

doi：10.4268/cjcmm20160909

微毒測試技術(shù)是一種利用發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行的生物活體檢測技術(shù)。20世紀(jì)70至80年代初，國外科學(xué)家首次從海魚體表分離和篩選出對(duì)人體無害、對(duì)環(huán)境敏感的發(fā)光細(xì)菌，用于抗生素、麻醉藥物的篩選及水體生物毒性的檢測等，現(xiàn)已成為一種簡便、快速的生物急性毒性檢測手段[1]。本課題組在國內(nèi)外首次將微毒生物測試技術(shù)擴(kuò)展到中藥注射劑綜合急性毒性的檢測領(lǐng)域，試圖解決現(xiàn)階段僅對(duì)已知有效成分的測定遠(yuǎn)不能滿足作為中藥注射劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的問題[2]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，對(duì)微毒測試體系方法學(xué)進(jìn)行優(yōu)化與驗(yàn)證，進(jìn)一步提高該方法的應(yīng)用范圍與可靠性。

1材料

費(fèi)氏弧菌Vibrio fischeri（Vf）CS234凍干粉試劑盒，編號(hào)D15G046，D15G037，D15G038，D15G039，D15G056，D15G033，北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，-20 ℃避光凍存。

復(fù)蘇稀釋液（3%氯化鈉溶液），批號(hào)20150717，北京濱松光子技術(shù)股份有限公司。滲透壓調(diào)節(jié)液（20%氯化鈉溶液），批號(hào)20150717，北京濱松光子技術(shù)股份有限公司。七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O），AR，批號(hào)2015030101，成都市科龍化工試劑廠。鹽酸（HCl），AR，批號(hào)20131028，成都金山化學(xué)試劑有限公司。氫氧化鈉（NaOH），AR，批號(hào)20110328，成都長聯(lián)化工試劑有限公司。

LUMIStox 300型生物毒性測試儀、LUMIStherm型預(yù)溫槽和測試管（Dr Bruno Lange GmbH公司）；ME203/02型電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；KCL2000型恒溫恒濕箱（東京理化器械株式會(huì)社）；Z2000型原子吸收分光光度計(jì)（日立公司）；鋅空心陰極燈（北京有色金屬研究院）；Integral 5型純水儀（法國MilliQ公司）；PB10型酸度計(jì)（Sartorius公司）。

2方法

21反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用PlackettBurman法將反應(yīng)條件中的6個(gè)因子進(jìn)行全面考察。選擇 11因子2水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1，共進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)，以 B，D，F(xiàn)，H，K 為空項(xiàng)估計(jì)試驗(yàn)誤差，A，C，E，G，J，L 分別代表平衡時(shí)間、復(fù)蘇液體積、復(fù)蘇時(shí)間、菌液體積、樣品體積和反應(yīng)時(shí)間，每個(gè)因素取高低2水平，以各測試組方差P及發(fā)光系數(shù)的均值偏差D為判斷標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳組合。使用到發(fā)光菌的所有操作均在（15±1） ℃條件下完成。

221特異性分別取復(fù)蘇稀釋液、滲透壓調(diào)節(jié)液、ZnSO4·7H2O儲(chǔ)備液和費(fèi)氏弧菌CS234菌液各01 mL于485 nm處測試發(fā)光強(qiáng)度。

222線性范圍、靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度精密稱取ZnSO4·7H2O 500 mg置于500 mL量瓶中，超純水充分溶解、定容，即得1000 mg·L-1儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液用超純水稀釋，得質(zhì)量濃度分別為50，200，400，800 mg·L-1系列溶液，再將各濃度標(biāo)準(zhǔn)毒物與滲透壓調(diào)節(jié)液以17∶3混合，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的各點(diǎn)，按照21所優(yōu)化的條件進(jìn)行測試，ZnSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的反應(yīng)終濃度為386，1545，3091，6182，7727 mg·L-1。以公式（1）計(jì)算抑制率Ht和均值偏差D，并以HtZnSO4·7H2O濃度作圖，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及R2；靈敏度用定量下限即386 mg·L-1（終濃度）標(biāo)準(zhǔn)毒物的精密度和準(zhǔn)確度表示。另取ZnSO4·7H2O儲(chǔ)備液用超純水配制150，500，900 mg·L-1溶液，再將各濃度標(biāo)準(zhǔn)毒物與滲透壓調(diào)節(jié)液以17∶3混合，作為質(zhì)量控制樣品，反應(yīng)終濃度為1159，3864，6955 mg·L-1，用以考察方法學(xué)的精密度（批間、批內(nèi)）和準(zhǔn)確度，精密度以RSD表示，準(zhǔn)確度以測得值與實(shí)際值的百分比表示。

fkt=Ikt / I0（1）

D=（fkt±fkt）/fkt×100% （2）

Ict=Ic × fkt （3）

Ht=（Ict-It）/Ict×100%（4）

I0為對(duì)照管發(fā)光菌初始發(fā)光強(qiáng)度，Ikt為對(duì)照管發(fā)光菌與復(fù)蘇稀釋液接觸一定時(shí)間后的發(fā)光強(qiáng)度，fkt為發(fā)光系數(shù)。D為發(fā)光系數(shù)的均值偏差，fkt為2個(gè)平行管fkt的平均值。Ict為樣品管發(fā)光菌初始發(fā)光強(qiáng)度的校正值，Ic為樣品管發(fā)光菌初始發(fā)光強(qiáng)度。It為樣品管發(fā)光菌與樣品接觸一定時(shí)間后的發(fā)光強(qiáng)度，Ht為樣品對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的抑制率。

223穩(wěn)定性取ZnSO4·7H2O儲(chǔ)備液及150，500，900 mg·L-1質(zhì)量控制樣品進(jìn)行Zn2+穩(wěn)定性考察。由于原子吸收分光光度計(jì)測量Zn2+的線性范圍在02～09 mg·L-1，故將儲(chǔ)備液稀釋到0538 mg·L-1（以Zn2+計(jì)）后考察0，2，4，6，8，24，48，72，120 h的穩(wěn)定性，質(zhì)量控制樣品分別稀釋到0137，0457，0822 mg·L-1考察0，2，4，6，8 h的穩(wěn)定性，并以相應(yīng)濃度的滲透壓調(diào)節(jié)液作為對(duì)照，需過夜樣品密封后置在4 ℃冰箱內(nèi)保存。

224pH對(duì)費(fèi)氏弧菌CS234的影響測試不同pH復(fù)蘇液（40，45，50，60，70，80，90）對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。用1 mol·L-1 HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，加入樣品中的體積不超過總體積的5%，每個(gè)pH設(shè)2個(gè)平行管，重復(fù)2次。由公式（3），（4）計(jì)算得到不同pH對(duì)費(fèi)氏弧菌CS234發(fā)光強(qiáng)度的抑制率及其平均值。

23數(shù)據(jù)分析

Design Expert 805b軟件進(jìn)行PlackettBurman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。PEMS 31軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合及IC50的計(jì)算。

3結(jié)果

31反應(yīng)條件優(yōu)化

由于各測試組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則按照ISO 113483：2007的標(biāo)準(zhǔn)選擇D<3%者為合格組合[3]，見表2。第3，4號(hào)實(shí)驗(yàn)組3次D均<3%，且以前者更優(yōu)，故選定發(fā)光條件為費(fèi)氏弧菌CS234凍干粉于恒溫箱中平衡15 min，加入復(fù)蘇液1 mL后混勻10 min，取100 μL菌液測試初始發(fā)光強(qiáng)度后立即加入1 mL復(fù)蘇液（對(duì)照）或待測樣品，反應(yīng)10 min后再次測試對(duì)照管及樣品管發(fā)光強(qiáng)度。

32特異性

復(fù)蘇稀釋液、滲透壓調(diào)節(jié)液、ZnSO4·7H2O儲(chǔ)備液的發(fā)光強(qiáng)度均在001～002，而費(fèi)氏弧菌CS234菌液的發(fā)光強(qiáng)度在1 152～1 177，說明前三者不干擾費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的測定，本方法特異性強(qiáng)，見表3。

33線性范圍、靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度

定量下限樣品及質(zhì)量控制樣品精密度均<10%，準(zhǔn)確度在858%～1032%，見表4。ZnSO4·7H2O溶液在386～7727 mg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2178lnx-1514，R2=0998，本方法下ZnSO4·7H2O對(duì)費(fèi)氏弧菌CS234的IC50為1990 mg·L-1。

34穩(wěn)定性

ZnSO4·7H2O儲(chǔ)備液及其質(zhì)量控制樣品分別連續(xù)考察120，8 h，其RSD均<2%，提示在室溫及4 ℃保存條件下穩(wěn)定性良好，見表5。

35pH對(duì)費(fèi)氏弧菌CS234的影響

pH 45～80時(shí)，費(fèi)氏弧菌CS234發(fā)光的波動(dòng)<10%，見表6。表2PlackettBurman設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=2）

目前常用的發(fā)光菌急性毒性測試方法主要有使用費(fèi)氏弧菌NRRL B11177株的國際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO 113483： 2007《Water qualityDetermination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri（Luminescent bacteria test）Part 3： Method using freezedried bacteria》和使用明亮發(fā)光桿菌T3小種的中國國標(biāo)GB/ T154411995《水質(zhì)急性毒性的測定發(fā)光細(xì)菌法》[5]，由于國內(nèi)尚無費(fèi)氏弧菌的急性毒性測試方法，故其測試過程常參照后者。GB/T 154411995以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的平均值（%），見公式（5），（6）及樣品質(zhì)量濃度（mg·L-1）擬合二元一次線性方程來表示樣品的急性毒性，而本室前期研究顯示費(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長呈下降趨勢[6]，因此，這既不能消除發(fā)光菌自身發(fā)光強(qiáng)度的變化所產(chǎn)生的誤差，也不能反映發(fā)光反應(yīng)的核心——熒光素酶動(dòng)力學(xué)的變化規(guī)律，故ISO標(biāo)準(zhǔn)中通過引入fkt，見公式（1），這一相對(duì)恒定的發(fā)光系數(shù)來校正該誤差，就顯得更為合理[7]。對(duì)于其他未嚴(yán)格規(guī)定的反應(yīng)條件如平衡時(shí)間、混勻時(shí)間等，結(jié)合本試劑盒的實(shí)際情況，采用分辨度為Ⅲ級(jí)的PlackettBurman法設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)，并優(yōu)化出最穩(wěn)定的發(fā)光反應(yīng)體系。

相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=標(biāo)準(zhǔn)毒物/樣品管發(fā)光強(qiáng)度空白管發(fā)光強(qiáng)度（5）

相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度平均值=重復(fù)1+重復(fù)2+重復(fù)33（6）

ISO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：對(duì)照管與樣品管的均值偏差D<3%、隨行標(biāo)準(zhǔn)毒物與費(fèi)氏弧菌反應(yīng)30 min后的抑制率達(dá)到20%～80%即認(rèn)為該測試批次合格。然而，D<3%僅能控制測試的精密度而不能保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，且樣品反應(yīng)時(shí)間少于30 min便無法適應(yīng)該標(biāo)準(zhǔn)，因此，在ISO標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，建立了以ZnSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)毒物的質(zhì)量控制系統(tǒng)，增加了ZnSO4·7H2O 3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品對(duì)測試方法學(xué)開展了進(jìn)一步的考察。ZnSO4·7H2O對(duì)人體及環(huán)境的損害遠(yuǎn)小于氯化汞、重鉻酸鉀及苯酚等現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)毒物，且Zn2+對(duì)發(fā)光菌作用的靶點(diǎn)主要在于影響其熒光素酶系統(tǒng)及發(fā)光基因表達(dá)[89]，也為本課題進(jìn)一步的深入提供了依據(jù)。

此外，還考察了pH對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光的影響。注射劑應(yīng)具有與血液相等或相近的pH，一般為pH 4～9，那么，明確該范圍是否適合發(fā)光細(xì)菌正常的生理活動(dòng)，將直接決定微毒生物測試體系的應(yīng)用范圍。結(jié)果顯示，pH 45～80對(duì)細(xì)菌發(fā)光的抑制率在±10%內(nèi)，可滿足絕大多數(shù)中藥注射劑的檢測需要。

綜上，本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)費(fèi)氏弧菌反應(yīng)條件的優(yōu)化及方法學(xué)的考察，建立了適用于CS234這一菌株的測試體系，本方法具有良好的特異性、穩(wěn)定性、靈敏度、準(zhǔn)確度及適應(yīng)性，為中藥注射劑微毒急性毒性測試打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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