楊曉明，李彩紅，孫冬霞，竇海燕

(1.邯鄲市婦幼保健院 婦一科，河北 邯鄲 056001；2.邯鄲市婦幼保健院 病理科，河北 邯鄲 056001)

萊菔硫烷抑制宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

楊曉明1Δ，李彩紅1，孫冬霞2，竇海燕1

(1.邯鄲市婦幼保健院 婦一科，河北 邯鄲 056001；2.邯鄲市婦幼保健院 病理科，河北 邯鄲 056001)

目的 研究萊菔硫烷對(duì)宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能機(jī)制。方法 將萊菔硫烷作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞，采用MTT和Edu比色法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖的抑制作用；采用Western blot檢測(cè)c-Myc的蛋白表達(dá)水平，腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)腫瘤干細(xì)胞的影響。結(jié)果 MTT和Edu比色法顯示，萊菔硫烷能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的體外增殖，Western blot 結(jié)果表明，萊菔硫烷可以下調(diào)c-Myc蛋白的表達(dá)從而抑制增殖。結(jié)論 萊菔硫烷對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用；其機(jī)制可能與下調(diào)c-Myc表達(dá)有關(guān)。

萊菔硫烷；宮頸癌；Hela細(xì)胞；增殖；c-Myc

宮頸癌是女性各種惡性腫瘤中最常見的癌癥，在全球惡性腫瘤中發(fā)病率高居第2位，病死率居第4位，全世界每年有超過25萬(wàn)患者死于宮頸癌[1]，宮頸癌已成為嚴(yán)重危害婦女健康的惡性疾病。宮頸癌患者死亡的主要原因是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，雖然已經(jīng)有一部分化療藥物運(yùn)用于臨床，如順鉑、異環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶等，但效果不甚理想，化療藥物副作用大且容易產(chǎn)生耐藥，增加了宮頸癌的治療難度，因此從天然植物中尋找高效低毒的抗腫瘤活性成分成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。萊菔硫烷(Sulforaphane，SF)是一種從綠花椰菜或綠花椰菜幼芽中提取的經(jīng)葡糖異硫氰酸鹽轉(zhuǎn)化的天然化合物，它一方面可以促進(jìn)成癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞阻滯，另一方面可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Ⅱ型解毒酶——谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)和醌還原酶(QR)，此酶能中和可疑致癌物質(zhì)，防止致癌物質(zhì)破壞健康細(xì)胞內(nèi)的遺傳因子，從而起到抗癌作用[2-3]。值得肯定的是該成分不會(huì)在人體內(nèi)殘留，對(duì)機(jī)體無(wú)副作用，可以作為一種新型的抗癌成分，它的抗腫瘤效應(yīng)在不同的腫瘤中已經(jīng)得到證實(shí)。例如，口服或靜脈注射萊菔硫烷可抑制前列腺癌PC-3和胰腺癌Panc-1移植瘤的腫瘤生長(zhǎng)[4-5]；絕經(jīng)前婦女可通過口服萊菔硫烷來(lái)降低人患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[6]，此外萊菔硫烷還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)[7]。研究表明，萊菔硫烷可以通過誘導(dǎo)配體干擾NF-kB抗凋亡通路，引起TNF-a相關(guān)凋亡從而有效阻斷胰腺癌的腫瘤耐藥[5]。萊菔硫烷即使在較低的藥物濃度下仍可以有效抑制乳腺癌干細(xì)胞[8]。

c-Myc基因是myc基因家族的重要成員之一，屬核蛋白基因，具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，并具有與染色體DNA結(jié)合的特性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用[11-13]。目前認(rèn)為很多惡性腫瘤中都有myc基因的擴(kuò)增或過度表達(dá)，c-Myc基因和產(chǎn)物在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[13-16]，有可能成為判斷預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)，同時(shí)也成為治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)。

已有研究證實(shí)萊菔硫烷可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡[17-18]，但關(guān)于萊菔硫烷抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究較少。本實(shí)驗(yàn)將探討萊菔硫烷對(duì)宮頸癌細(xì)胞株HeLa增殖的影響，觀察萊菔硫烷是否可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，是否可調(diào)控與宮頸癌呈密切相關(guān)的致癌基因c-Myc的表達(dá)。目的是從細(xì)胞與分子生物學(xué)水平探討萊菔硫烷抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，為臨床治療宮頸癌提供有效理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株:人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞購(gòu)于自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。

1.1.2 試劑：Sulforaphane (Sigma,America)溶解于無(wú)菌的二甲基亞砜(DMSO)中，配制成濃度為10 mmol/L的貯存液， -20 ℃ 保存，RPMI培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone)MTT(噻唑藍(lán))，DMSO,Edu試劑盒均購(gòu)自廣州斯佳生物公司。Wesern blot中使用的抗體來(lái)源：c-Myc(Santa Cruz,America)，GAPDH(北京康為世紀(jì))。

1.1.3 儀器：細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；垂直凝膠電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜及曝光儀和Model 680酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司)；正置熒光顯微鏡(Eclipse 80i，尼康公司)；光學(xué)顯微鏡(BDS200，日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HeLa細(xì)胞株采用5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，青霉素100 U/mL,鏈霉素100 ug/mL,于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞對(duì)萊菔硫烷的藥物敏感性(IC50)：于96孔板中按照每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種，每孔體積200 μL,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，第2天分別加入不同濃度的萊菔硫烷稀釋液(濃度分別為80、40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L)各培養(yǎng)3 d。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL,37 ℃培養(yǎng)4 h后小心棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO,室溫避光搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白孔為對(duì)照，用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，OD值的大小表示細(xì)胞增殖能力大小。各組取平均值，重復(fù)3次，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，OD值為0.5左右的對(duì)應(yīng)的是藥物的IC50。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)HeLa細(xì)胞增殖能力的影響：于96孔板中按照每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種，每孔體積200 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組不加藥，處理組加入10 μmol/L的萊菔硫烷稀釋液各培養(yǎng)5 d。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h后小心棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，室溫避光搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白孔為對(duì)照，用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，OD值的大小表示細(xì)胞增殖能力大小。各組取平均值，重復(fù)3次，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 Edu實(shí)驗(yàn)：以每孔4×103細(xì)胞接種于96孔板中，加入10 μmol/L的萊菔硫烷稀釋液，培養(yǎng)48 h后用細(xì)胞培養(yǎng)基按1000:1的比例稀釋EdU溶液，培養(yǎng)4 h，PBS清洗細(xì)胞2次，每次5 min，經(jīng)4%甲醇固定和Apollo染色，DAPI染核，顯微鏡下觀察多視野拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)c-Myc蛋白的表達(dá)水平：HeLa細(xì)胞加入10 μmol/L萊菔硫烷處理后，分別作用24、48 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液100 uL，置于冰上裂解30 min，12000 g 4 ℃離心15 min，收集上清-80 ℃保存，按BCA蛋白檢測(cè)試劑盒中的方法進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，凝膠上的蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以3%BSA室溫封閉1 h,按照1:1000的比例分別加入一抗c-Myc和內(nèi)參抗體GAPDH，4 ℃孵育過夜，加入相對(duì)應(yīng)的二抗孵育1 h，于暗室曝光顯影、定影。

2 結(jié)果

2.1 HeLa細(xì)胞對(duì)萊菔硫烷的藥物敏感性(IC50)的檢測(cè) 萊菔硫烷在2.5～80 μmol/L的范圍內(nèi)均可以抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖， 10 μmol/L的萊菔硫烷，對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制率為55.3%?？梢曌鱄eLa細(xì)胞對(duì)萊菔硫烷的IC50=10 μmol/L，作為后續(xù)試驗(yàn)加藥濃度的基礎(chǔ)。見圖1。

圖1 MTT檢測(cè)HeLa細(xì)胞對(duì)萊菔硫烷的藥物敏感性Fig.1 The sensitivity of HeLa Cells to Sulforaphane examined by MTT

2.2 MTT檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞體外增殖能力的影響 與對(duì)照組相比，隨著處理時(shí)間增加，萊菔硫烷處理組HeLa細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，第3天時(shí)2組細(xì)胞數(shù)量差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明萊菔硫烷可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。見圖2。

圖2 MTT檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞體外增殖能力的影響NC：對(duì)照組；SF：萊菔硫烷處理組*P<0.05Fig.2 Effect of sulforaphane on the growth of Hela cell detected by MTTNC：control group；SF：Sulforaphane-treated group*P<0.05

2.3 Edu實(shí)驗(yàn)檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞體外增殖能力的影響 與對(duì)照組[(45.2±3.6)%]相比，萊菔硫烷處理組[(20.6±4.8)%] HeLa細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(t=15.16，P=0.021)，表明萊菔硫烷可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。見圖3。

圖3 Edu檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞體外增殖能力的影響(×20)NC：對(duì)照組；SF：萊菔硫烷處理組*P<0.05，與NC組相比Fig.3 Effect of sulforaphane on the growth of Hela cell detected by Edu(×20)NC：control group；SF：Sulforaphane-treated group*P<0.05，compared with NC group

2.4 Western blot 檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)HeLa細(xì)胞中c-Myc表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，經(jīng)萊菔硫烷處理的細(xì)胞c-Myc的蛋白明顯下調(diào)(F=149.188，P<0.001)，48 h組比24 h組的c-Myc蛋白表達(dá)更低(P<0.001)，表明藥物的作用呈時(shí)間依賴性。見圖4。

圖4 Western blot 檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)HeLa細(xì)胞中c-Myc表達(dá)的影響**P<0.001Fig.4 Effect of sulforaphane on the expression of c-Myc detected by Western blot**P<0.001

3 討論

腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力賦予其永生化和轉(zhuǎn)移的能力，是導(dǎo)致臨床治療失敗的關(guān)鍵原因?，F(xiàn)有的化療藥物治療效果不甚滿意，且副作用大，容易引起耐藥，是化療藥物治療腫瘤的缺陷。尋求副作用小且無(wú)毒的植物成分成為近年來(lái)抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外大量研究表明萊菔硫烷在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4-5]。本研究也發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷在2.5～80 μmol/L濃度范圍均能抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，MTT和Edu實(shí)驗(yàn)顯示10 μmol/L的萊菔硫烷可以明顯的抑制細(xì)胞增殖。

c-Myc基因不僅參與腫瘤細(xì)胞的調(diào)控增殖，分化與凋亡，而且參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19]，可以促進(jìn)G0期細(xì)胞轉(zhuǎn)入分裂周期,微注射c-Myc蛋白于細(xì)胞質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其可以轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，促使細(xì)胞進(jìn)入增殖周期[20-21]。許多惡性腫瘤組織中c-Myc基因表現(xiàn)異常，如c-Myc基因擴(kuò)增，mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，都可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的過度增殖。同時(shí)c-Myc還可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生[20]，它通過自我更新和無(wú)限增值維持著腫瘤細(xì)胞群的生命力，它的運(yùn)動(dòng)和遷徙能力又使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移成為可能，且可以長(zhǎng)時(shí)間處于休眠狀態(tài)，對(duì)化療藥物和放療不敏感，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞往往在常規(guī)治療方法消滅大部分普通腫瘤細(xì)胞一段時(shí)間后復(fù)發(fā)。

Edu(5-Ethynyl-2’- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子中，通過基于Edu與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性，是一種新型的研究細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)。

目前關(guān)于萊菔硫烷抑制宮頸癌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究甚少，本文采用Western blot檢測(cè)萊菔硫烷對(duì)c-Myc蛋白的表達(dá)水平的影響，研究發(fā)現(xiàn)，萊菔硫烷可以明顯降低c-Myc蛋白的表達(dá)，已有研究證明萊菔硫烷可以直接結(jié)合c-Myc的啟動(dòng)子區(qū)域而下調(diào)其表達(dá)水平[21],與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果為萊菔硫烷臨床治療宮頸癌物提供了理論支持。

綜上所述，萊菔硫烷抑制HeLa細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過下調(diào)c-Myc蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

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編校(苗加會(huì))

Study on the inhibitory effects and mechanism of Sulforaphane on human cervical cancer Hela cell

YANG Xiao-ming1Δ, LI Cai-hong1, SUN Dong-xia2, DOU Hai-yan1

(1.Department of Gynecology, Handan Maternal and Child Health-Care Hospital, Handan 056001, China; 2.Department of Pathology, Handan Maternal and Child Health-Care Hospital, Handan 056001, China)

ObjectiveTo determine the effect of sulforaphane on human cervical cancer HeLa cells as well as its potential mechanism.MethodsThe proliferation activity were examined by MTT and Edu assay after treated with sulforaphane.Western blot was used to detect the expression level of c-Myc.ResultsMTT and Edu assay showed that sulforaphane can inhibit the growth of Hela cells, and the results of Western blot indicated that sulforaphane downregulated the expression of c-Myc protein.ConclusionSulforaphane can significantly suppress the proliferation of HeLa cells.The mechanism may be associated with reduced expression of c-Myc.

Sulforaphane; Cervical cancer; Hela cells; Proliferation; c-Myc

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.09

楊曉明，通信作者，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向:婦科腫瘤疾病診治研究，E-mail:yangxiaomingppa@163.com。

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