張藝齡， 張 振， 陳向東

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院皮膚科，上海 200011)

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·基礎研究·

微等離子體射頻技術對人體皮膚組織及相關因子的影響

張藝齡， 張 振， 陳向東

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院皮膚科，上海 200011)

目的 探討微等離子體射頻技術治療凹陷性瘢痕及面部年輕化的可能作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。方法 使用相同治療參數(shù)的微等離子體射頻技術分別照射受試者的左背部皮膚，在術后即刻和術后1、3、5、7、14、28、90、180d，于照射區(qū)域及非照射區(qū)域分別取皮膚活檢，對活檢的皮膚標本分別作H-E染色，Masson三色染色，Ⅰ型及Ⅲ型膠原、VEGF、熱休克蛋白70(heat shock proteins 70， HSP70)免疫組化染色。結果 微等離子體作用于皮膚后產(chǎn)生不連續(xù)分布的熱氣化區(qū)。照射后5d膠原纖維開始增多，并持續(xù)至照射后180d。照射后即刻，VEGF就開始高表達，并維持28d左右。照射3d后，HSP70就開始增加，主要表達在表皮和真皮淺層，7d到達高峰，并維持90d。結論 微等離子體射頻作用于人體皮膚組織可以刺激人皮膚真膠原纖維和彈力纖維增生，并且持續(xù)時間可達半年。

微等離子體； 膠原蛋白； 血管內(nèi)皮生長因子； 熱休克蛋白70

微等離子體技術是一種微創(chuàng)式剝脫性點陣模式新技術，臨床上主要應用于痤瘡后凹陷性瘢痕和光老化性細紋，療效較為確切。微等離子體技術是由多點單極射頻在距離皮膚很微小的距離內(nèi)激發(fā)空氣中的氮氣分子，并形成等離子放電，產(chǎn)生的電火花引起皮膚輕微的剝脫，其能量以點陣形式發(fā)射，形成“微剝脫區(qū)”，在皮膚上形成表皮至真皮上層可以控制的小孔；當治療頭與皮膚接觸時，單極射頻的能量使真皮層受到高溫刺激，形成陣列樣排列的“熱損傷區(qū)”。目前，國內(nèi)外尚無微等離子體技術作用于人活體的組織病理研究，且對治療后真皮膠原含量的變化也沒有定量分析。故本研究進行相關的測定，為臨床治療提供理論依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 一般資料

健康蒙古利亞人種志愿者3名，年齡24～55歲。Fitzpatrick皮膚類型Ⅲ～Ⅳ型。排除孕婦、哺乳期、有增生性瘢痕及瘢痕疙瘩史、光敏性疾病、6個月內(nèi)服用過維A酸類藥物或接受過激光治療者、試驗期有系統(tǒng)或局部感染者。

1.2 方法

1.2.1 微等離子體治療及取材 采用閃耀TM離子束射頻治療儀(以色列飛頓激光公司)，選擇左背部皮膚作為治療區(qū)域，相同光照條件下拍照。術前清水清潔治療區(qū)域皮膚，復方利多卡因乳膏(北京紫光制藥有限公司)封包1h麻醉，酒精清潔治療區(qū)域皮膚。治療模式采用滾輪頭，治療4遍，能量80W，釋放持續(xù)時間30s。術后創(chuàng)面避水3d。在治療后即刻，術后1、3、5、7、14、28、90、180d分別在照射部位和非照射部位取活檢。

1.2.2 標本處理 取得的活檢標本立刻放入0.1mol/L 磷酸酸鹽緩沖的10%甲醛溶液，固定24h。固定后的標本脫水，石蠟包埋切片。切片后分別進行H-E染色，Masson三色染色，Ⅰ型及Ⅲ型膠原、VEGF、熱休克蛋白70免疫組化染色。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 微等離子體照射后膠原纖維變化

H-E染色結果顯示，熱氣化區(qū)寬而淺，并環(huán)繞以相應的熱凝固區(qū)。照射3d后，表皮完全復上皮化。照射7d后，開始痂皮脫落。通過H-E常規(guī)染色、Masson三色膠原特殊染色可以發(fā)現(xiàn)，皮膚在未照射微等離子體時，真皮淺層膠原纖維稀疏，纖細，真皮深層膠原纖維分布紊亂，不規(guī)則。照射后1、3、5、7、14d后，真皮膠原未見明顯變化。照射28d后，淺層膠原纖維變粗，真皮深層膠原纖維排列整齊，粗大。膠原在真皮全層均有增強，表現(xiàn)為新生的膠原重排，膠原纖維的走行方向與表皮大體平行，真皮淺層的膠原沉積增多。免疫組織化學染色(棕黃色為染色陽性)的結果與H-E常規(guī)染色結果大致符合。Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化染色結果顯示，照射5d后，Ⅲ型膠原就染色開始增強，尤其以真皮淺層增強明顯。Ⅰ型膠原免疫組化染色結果顯示，照射28d后，Ⅰ型膠原染色明顯增強，真皮淺層及深層染色均增強，并于90d到達峰值，與未照射組相比差異顯著(P<0.05)，見圖1。

2.2 微等離子體照射后VEGF的動態(tài)變化

免疫組化顯示，對照組VEGF弱表達。在照射4h后即可觀察到皮膚表皮和真皮淺層VEGF表達增加。照射3、5、7、14、28d后，VEGF表達繼續(xù)增加。此后VEGF表達下降。照射90d后，VEGF表達下降到與對照組類似，此后VEGF表達基本無太大的變化，見表1。

2.3 微等離子體照射皮膚HSP70的動態(tài)變化

免疫組化顯示，對照組HSP70呈弱陽性。微等離子體照射皮膚3d后，HSP70的表達開始上調(diào)。此后HSP70進一步增強。照射7d后達到高峰，此后HSP70表達下降，照射90d后才降到基礎值，見表1。

圖1 微等離子體照射后Masson三色膠原特殊染色及Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化染色Fig.1 Masson staining and typeⅠand Ⅲ collagen immunohistochemical staining after irradiation of microplasma radiofrequency

表1 微等離子體照射后Ⅰ、Ⅲ型膠原、VEGF、HSP70的動態(tài)變化

指標未照射區(qū)照射區(qū)即刻1d3d5d7d14d28d90d180dⅠ型膠原0.074±0.0110.068±0.0050.075±0.0110.063±0.0140.058±0.0130.067±0.0080.058±0.0050.093±0.0140.109±0.0070.141±0.016Ⅲ型膠原0.047±0.0090.048±0.0100.052±0.0090.059±0.0060.062±0.0100.064±0.0120.070±0.0100.072±0.0100.081±0.0120.083±0.013VEGF0.088±0.0100.199±0.0400.223±0.0520.196±0.0480.204±0.0600.194±0.0300.218±0.0360.158±0.0160.086±0.0170.095±0.010HSP700.069±0.0040.070±0.0050.073±0.0070.116±0.0100.127±0.0220.126±0.0240.105±0.0080.111±0.0070.085±0.0070.075±0.005

3 討 論

2005年，等離子體治療儀應用于皮膚外科，其通過氮氣等離子體高溫燒灼而非光或射頻能量傳遞進行治療。微等離子體技術是新近才開發(fā)出來的一種微創(chuàng)燒灼性技術，它利用多點單極射頻，將設備的手具與皮膚之間的空氣中的氮氣分子解離為氣態(tài)的電子和光子，即所謂等離子化，引起皮膚輕微的剝脫，在皮膚上形成表皮和真皮淺層可以控制的點陣形式的微小穿孔，形成“微剝脫區(qū)”[1]。目前，臨床上微等離子體治療細紋和痤瘡后凹陷性瘢痕的效果較確切[2-3]，但治療的組織學變化和內(nèi)在機制卻不完全清楚。

本研究顯示，微等離子體照射后即刻，表皮和真皮淺層出現(xiàn)非連續(xù)性氣化區(qū)和熱凝固區(qū)。Ⅲ型膠原在照射5d后開始明顯增加，Ⅰ 型膠原在照射30d后開始明顯增加，與臨床療效較為符合。推測膠原增加的原因可能為微等離子體對皮膚表皮的真皮淺層形成熱損傷，引起機體的創(chuàng)傷修復機制，刺激膠原纖維增生。

此外，Ⅲ型膠原的增加是持續(xù)的，在觀察終點，即術后180d發(fā)現(xiàn)Ⅲ型膠原仍然比未照射區(qū)的含量明顯增加，與創(chuàng)傷愈合早期Ⅲ型膠原含量增多，隨著時間推移其含量逐漸恢復正常的傳統(tǒng)觀點不符。本研究推測其可能的原因是微等離子體造成的創(chuàng)傷與一般的創(chuàng)傷不同，模式是微小而持續(xù)的，這樣可以持續(xù)刺激機體產(chǎn)生新的膠原。

本研究首次觀察了微等離子體作用于人體皮膚后膠原增生的時間變化規(guī)律，為微等離子體技術的臨床治療提供了重要的幫助。本研究顯示，照射180d后，真皮的膠原纖維含量達到最大值，即在治療后半年，微等離子體技術的膠原重排和增生作用才達到最優(yōu)結果。目前，臨床上該技術治療痤瘡后凹陷性瘢痕的治療間隔一般為1～3個月，只是臨床上的經(jīng)驗值，沒有明確的組織病理學支持。本研究提示，微等離子體技術的臨床治療間隔時間半年更為合理。

微等離子體技術可能通過熱損傷激活皮膚創(chuàng)傷修復過程來達到刺激真皮膠原增生的作用。熱誘導的創(chuàng)傷修復可能涉及多種因子。越來越多的研究[4-5]表明，VEGF在增生期可能有助于傷口的愈合與組織修復。VEGF促進傷口愈合通過多種機制，包括膠原蛋白的沉積，血管生成等。本研究觀察了VEGF在傷口愈合的不同階段的動態(tài)變化。在微等離子體作用于皮膚1h后即可觀察到VEGF水平明顯高于對照組。此后VEGF的表達逐漸升高，照射28d后到達峰值。從理論上講，VEGF誘導的血管舒張和血管通透性增加發(fā)生允許氧氣和葡萄糖運送和沉積在傷口附近，可以認為VEGF可作為一種有效的血管擴張劑。本研究證實微等離子體技術引起的傷口愈合的早期階段中血管內(nèi)皮生長因子的作用。從成纖維細胞釋放VEGF是缺氧依賴性的。在熱損傷導致傷口愈合的重塑階段，VEGF對膠原蛋白的直接影響仍有待確定。在本研究中，膠原蛋白均有顯著增加，Ⅰ型膠原蛋白從照射28d后表達上調(diào)，Ⅲ型膠原蛋白從照射5d后表達上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在創(chuàng)傷修復早期表達上調(diào)，與Ⅲ型膠原蛋白早期即可上調(diào)相吻合。因此，本研究推斷Ⅲ型膠原蛋白的上調(diào)可能與VEGF有關。VEGF對傷口愈合中后期階段的細胞外基質(zhì)和瘢痕形成的影響，仍有進一步研究的需要。

熱休克蛋白是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)最豐富的蛋白質(zhì)之一，但是它們是在正常生理條件下低水平表達。只有在應對各種壓力的情況下熱休克蛋白才明顯上調(diào)。熱休克蛋白的功能主要是作為分子伴侶促進其他細胞蛋白質(zhì)的折疊，防止蛋白聚集，或誘發(fā)不當折疊的蛋白質(zhì)降解。創(chuàng)傷誘導的熱休克蛋白主要在表皮中上調(diào)。傷口中含有豐富的HSP蛋白通過維持細胞內(nèi)環(huán)境動態(tài)平衡和細胞的存活，來促進傷口愈合[6]。其中HSP70是HSP家族較重要的一族。HSP70的過表達增加成纖維細胞的生存及減少氧化損傷并抑制炎癥反應。

在本研究中，熱休克蛋白在微等離子體照射皮膚3d后表達增加，主要表達于表皮和真皮淺層，此后HSP70信號進一步增強，照射7d后達到峰值，此后陽性反應逐漸降低，但是仍然高于未照射時，并持續(xù)約90d。本研究結果表明： HSP70在微等離子體技術照射皮膚后的全程均有作用。HSP70可以促進新生成的膠原蛋白的正確折疊，抑制真皮成纖維細胞的凋亡等。因此，微等離子體技術作用于人體皮膚后，HSP70可能是其中較重要的一個分子機制。本研究對微等離子體技術作用于人體皮膚后的HSP70的動態(tài)變化進行了觀察，為微等離子體技術的治療提供了重要的理論依據(jù)。但是其治療還有許多其他分子參與，有待于進一步研究。

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Effects of microplasma radiofrequency technique on human skin tissue

ZHANGYi-ling，ZHANGZhen，CHENXiang-dong

(Dept. of Dermatology， Ninth People’s Hospital， Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200011， China)

Objective To investigate the effects of microplasma radiofrequency on human skin tissue. Methods Microplasma radiofrequency irradiation was performed on the left dorsal region of 3 healthy volunteers. Skin biopsies were taken from irradiated and non-irradiated regions immediately and 1， 3， 5， 7， 14， 28， 90， 180d after the treatment. H-E staining， Masson staining， and type Ⅰ/Ⅲ collagen， vascular endothelial growth factor(VEGF)， heat shock proteins 70(HSP70)immunohistochemical stainings were performed. Results The radiofrequency ablative zone was wide and shallow with thermal coagulation. Collagen fibers started to increase 5d after treatment and maintained until d180. The expression of VEGF was elevated right after the treatment and maintained about 30d. The expression of HSP70 was increased 3d after treatment， mainly in epidermis and papillary dermis； it reached to the peak on d7 and maintained about 90d， then decreased. Conclusion Microplasma radiofrequency can stimulate the long-term proliferation of collagen fibers and elastic fibers in human dermis. The study may provide a theoretical basis for microplasma radiofrequency technique in treatment of depressed scars.

microplasma； collagen； vascular endothelial growth factor； heat shock proteins 70

10.16118/j.1008-0392.2016.05.008

2016-01-15

張藝齡(1987—)，男，住院醫(yī)師，碩士.E-mail： xzyzzyl@163.com

陳向東.E-mail： xdchen@medmail.com.cn

R 751

A

1008-0392(2016)05-0040-04