槲皮素作為熒光探針對(duì)氟離子的識(shí)別作用

楊世龍，姜維娜，印 彬，徐 莉2, , 4*，趙俸藝，

高步紅4，孫海軍4，杜麗婷4，唐 穎4, 5，曹福亮2, 5

1. 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037 2. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210037 3. 南京林業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 210037 4. 南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測(cè)試中心，江蘇 南京 210037 5. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037

槲皮素作為熒光探針對(duì)氟離子的識(shí)別作用

楊世龍1, 2，姜維娜1, 2，印 彬3，徐 莉2, 3, 4*，趙俸藝2, 5，

高步紅4，孫海軍4，杜麗婷4，唐 穎4, 5，曹福亮2, 5

1. 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037 2. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210037 3. 南京林業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 210037 4. 南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測(cè)試中心，江蘇 南京 210037 5. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037

槲皮素；熒光探針；氟離子；陰離子；天然產(chǎn)物

引 言

氟是人體中不可缺少的元素，主要存在于骨骼和牙齒中，具有增強(qiáng)骨骼和牙齒強(qiáng)度等作用，但是體內(nèi)氟元素過高，會(huì)引起氟中毒，例如厭食、惡心、腹痛、胃潰瘍、內(nèi)臟器官損傷甚至死亡；氟元素過少則會(huì)出現(xiàn)軟骨病、齲齒等疾病[1-2]。隨著工業(yè)化的發(fā)展，氟元素廣泛應(yīng)用到化工、日化產(chǎn)品中，也造成了一定的環(huán)境污染，對(duì)人體健康的威脅不容忽視，因此，監(jiān)測(cè)體內(nèi)和環(huán)境中的氟含量是一項(xiàng)具有重大意義的工作。目前，檢測(cè)氟離子的方法有很多種，例如： 離子色譜法、氟離子選擇電極、光散射等[3-5]，這些方法都要用到許多精密儀器，保養(yǎng)維護(hù)工作較多，且對(duì)樣品前處理要求嚴(yán)格，操作程序較多，因此檢測(cè)成本高、效率較低。熒光光譜分析法具有檢測(cè)下限低，靈敏度較高，檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)于檢測(cè)陽離子、陰離子和藥物等。目前，用于識(shí)別氟離子的熒光探針[6-7]多為合成得到，而采用天然產(chǎn)物作為探針直接檢測(cè)氟離子還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用廣泛存在于植物體內(nèi)的槲皮素(Quercetin, Q)作為熒光探針來檢測(cè)氟離子。槲皮素是黃酮類化合物中最常見的一種，廣泛存在于植物的花、葉和果實(shí)中，例如銀杏葉、槐花米等。由于槲皮素具有抗氧化、擴(kuò)張血管、改善認(rèn)知能力等多種生物活性[8]，越來越受到人們的重視，目前有關(guān)槲皮素的研究主要集中于其生物活性，有關(guān)槲皮素的熒光性能研究較少。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]核苷酸可以增強(qiáng)槲皮素的熒光強(qiáng)度，由此根據(jù)槲皮素的熒光強(qiáng)度變化來測(cè)量核苷酸的含量，但未見槲皮素作為熒光探針檢測(cè)陰離子含量的報(bào)道。由于槲皮素含有多個(gè)酚羥基，易于形成氫鍵，而氫鍵的改變會(huì)影響槲皮素的共軛體系，對(duì)其熒光光譜產(chǎn)生影響，因此可以利用熒光光譜的變化來檢測(cè)陰離子。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Lambda 950紫外光譜儀(美國(guó)珀金埃爾默公司)；LS55熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)390 nm, 美國(guó)珀金埃爾默公司)；AVANCE Ⅲ600核磁共振儀(600M, BrukerBiospin)；電子天平(瑞士 METTLER TOLEDO公司)；WRR熔點(diǎn)儀(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)。

四丁基氟化銨，四丁基磷酸二氫銨，過氯酸四丁基銨(阿拉丁試劑有限公司)；四丁基碘化銨，四丁基氯化銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；四丁基溴化銨(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，南京化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 槲皮素的提取與純化

槲皮素按文獻(xiàn)方法從銀杏葉或槐花米中提取[10]。mp.>300 ℃；ESI-MSm/z301[M-H]-；1H NMR (DMSO-d6600 MHz): 12.50 (s, 1H, 5-OH), 10.78 (s, 1H, 7-OH), 9.59 (s, 1H, 3-OH), 9.37 (s, 1H, 4’-OH), 9.31 (s, 1H, 3’-OH), 7.68 (d,J=1.8 Hz, 1H, 2’-H), 7.54 (d×d,J1=10.8 Hz,J2=1.8 Hz, 1H, 6’-H), 6.89 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5’-H), 6.41 (d,J=2.4 Hz, 1H, 8-H), 6.19 (d,J=1.8 Hz, 1H, 6-H)。

1.2.2 槲皮素對(duì)陰離子的選擇性

為研究其他陰離子對(duì)槲皮素檢測(cè)氟離子的干擾，向槲皮素-氟離子體系中分別加入不同的陰離子，并檢測(cè)加入其他陰離子前后熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化。根據(jù)熒光發(fā)射強(qiáng)度變化來判斷其他陰離子對(duì)氟離子檢測(cè)的干擾程度，溶液中槲皮素與陰離子的濃度均為1×10-5mol·L-1。

1.2.3 槲皮素與氟離子的熒光滴定光譜

分別配制濃度為1×10-5mol·L-1的槲皮素DMSO溶液和濃度為4×10-4mol·L-1的四丁基氟化銨DMSO溶液。取2 mL槲皮素溶液，向其中連續(xù)加入5 μL 四丁基氟化銨溶液，充分混勻后測(cè)定熒光強(qiáng)度的連續(xù)變化，直至光譜不再有變化。

1.2.4 槲皮素與氟離子作用機(jī)理

為研究槲皮素與氟離子的作用機(jī)理，將槲皮素-氟離子體系溶于含有不同比例水的DMSO溶液中，考查熒光強(qiáng)度與含水比例的關(guān)系。

將等量槲皮素與四丁基氟化銨溶于DMSO-d6中，進(jìn)行核磁共振譜測(cè)試，根據(jù)核磁共振數(shù)據(jù)推測(cè)槲皮素與氟離子的作用機(jī)理。

1.2.5 氟離子的測(cè)定

為考查工作曲線的準(zhǔn)確性，配制濃度為1×10-5mol·L-1的槲皮素DMSO溶液，并分別配制濃度為1.0×10-3，2.2×10-3和 3.0×10-3mol·L-1的四丁基氟化銨DMSO溶液。取2 mL槲皮素溶液，向其中加入5μL 四丁基氟化銨溶液，使最終溶液中氟離子濃度分別為2.5×10-6，5.5×10-6和7.5×10-6mol·L-1，充分混勻后分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)工作曲線計(jì)算測(cè)量值和回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見光譜分析

圖1 不同陰離子對(duì)槲皮素的紫外-可見吸收光譜的影響(槲皮素與陰離子濃度均為1×10-5mol·L-1)

Fig.1 The influence of different anions on UV-Vis absorption ofQin DMSO([Q]=[anions]=1×10-5mol·L-1)

圖示1 槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 加入不同陰離子后槲皮素溶液顏色的變化

2.2 槲皮素對(duì)不同陰離子的選擇性

圖3 不同陰離子對(duì)槲皮素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響(a)和影響程度(b)(槲皮素與陰離子的濃度均為1×10-5mol·L-1)

Fig.3 Fluorescence intensity ofQresponse to different anions (a) and the degree of response to different anions (b) ([Q]=[anions]=1×10-5mol·L-1)

圖4 其他陰離子對(duì)槲皮素-氟離子體系熒光強(qiáng)度的影響(λex=390 nm，槲皮素濃度為1×10-5mol·L-1，氟離子濃度為4×10-6mol·L-1，其他陰離子濃度為1×10-5mol·L-1)

Fig.4The influence of other anions on fluorescent intensity of Q-F-system(λex=390 nm, [Q]=1×10-5mol·L-1, [F-]=4 ×10-6mol·L-1, the concentration of other anions was 1× 10-5mol·L-1)

圖5 槲皮素對(duì)氟離子的熒光滴定光譜和滴定曲線[槲皮素濃度為1×10-5mol·L-1，a～l氟離子濃度依次為： (0, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0)×10-6mol·L-1]

Fig.5 Fluorescence titration of Q and standard curve of fluorescence titration spectra with varying concentrations of F-in DMSO([Q]=1×10-5mol·L-1, from a to l, [F-]=(0, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 )×10-6mol·L-1)

2.3 槲皮素檢測(cè)氟離子的靈敏性

圖5為槲皮素與氟離子的熒光滴定光譜及其滴定曲線，隨著氟離子濃度的增大，槲皮素?zé)晒鈴?qiáng)度逐漸降低，當(dāng)氟離子濃度為9.0×10-6mol·L-1時(shí)，熒光滴定光譜基本無變化，達(dá)到飽和。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，氟離子的濃度為橫坐標(biāo)，得到滴定曲線(見圖5插圖)：y=-13.36x+173.4(R2=0.991)，線性范圍為1.0×10-6～8.0×10-6mol·L-1，最低檢測(cè)限為1.0×10-7mol·L-1，可以完成對(duì)氟離子的微量檢測(cè)。

2.4 槲皮素對(duì)氟離子的識(shí)別機(jī)理

受體與陰離子間的識(shí)別主要通過疏水作用、氫鍵作用、偶極作用及配位作用等[12]，可以通過實(shí)驗(yàn)來確定槲皮素與氟離子的識(shí)別機(jī)理。以 DMSO為溶劑分別配制1×10-4mol·L-1的槲皮素和氟離子溶液，分別量取100 μL于4個(gè)10 mL的容量瓶中，再分別用DMSO，80%，50%，20%的DMSO水溶液定容，充分搖勻后測(cè)定熒光光譜。由圖6可以看出，隨著溶液中水的比例增加熒光強(qiáng)度降低，這是由于質(zhì)子性溶劑水與槲皮素的DMSO溶液體系形成新的氫鍵，破壞了原有體系中氫鍵，致使熒光強(qiáng)度降低[13]；說明槲皮素?zé)晒鈴?qiáng)度的降低與整個(gè)體系的氫鍵作用有關(guān)。同理，氟離子的加入使熒光強(qiáng)度降低，也與引起原有體系氫鍵的變化有關(guān)。

圖6 極性溶劑-水對(duì)槲皮素-氟離子體系熒光強(qiáng)度的影響(a～d依次是DMSO, 80%, 50%, 20%的DMSO溶液)

Fig.6 Fluorescence intensity of Q-F-in protic solvent-H2O(from a to d, the solvents are DMSO, 80%, 50%, 20% DMSO aqueous solution, respectively)

為了進(jìn)一步確定槲皮素與氟離子的作用方式，對(duì)槲皮素-氟離子體系進(jìn)行了核磁共振譜測(cè)試。將等量槲皮素與四丁基氟化銨溶于DMSO-d6中測(cè)氫譜。圖7和表1為槲皮素與槲皮素-氟離子體系的核磁譜圖及相關(guān)數(shù)據(jù)，未加氟離子時(shí)，由于分子間、分子內(nèi)的氫鍵作用，槲皮素分子中的羥基氫被固定住，槲皮素分子剛性較強(qiáng)，分子中的氫原子核磁信號(hào)較強(qiáng)，峰形尖銳；加入氟離子后，槲皮素-氟離子體系的1H NMR圖中10.78 ppm(7—OH)處的峰消失，說明7—OH處的氫鍵完全被破壞。同時(shí)9.31，9.37和9.59 ppm處的峰變?yōu)?.68 ppm處的一寬峰，說明3—OH，3′—OH，4′—OH處的氫鍵作用也變?nèi)?。由此說明槲皮素對(duì)氟離子的識(shí)別過程是： 氟離子的加入破壞或減弱了體系原有的氫鍵，促進(jìn)了槲皮素分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，使槲皮素的熒光強(qiáng)度降低[14]。

圖7 槲皮素-氟離子體系(a)和槲皮素(b)的氫譜

表1 槲皮素和槲皮素-氟離子體系中氫原子的化學(xué)位移

表2 槲皮素作為熒光探針對(duì)DMSO溶液中氟離子的測(cè)定

2.5 樣品中氟離子的測(cè)定

配制濃度為1×10-5mol·L-1的槲皮素DMSO溶液，并分別配制濃度為1.0×10-3，2.2×10-3和3.0×10-3mol·L-1的四丁基氟化銨DMSO溶液。取2 mL槲皮素溶液，向其中加入5 μL 四丁基氟化銨溶液，使最終溶液中氟離子濃度為2.5×10-6，5.5×10-6和7.5×10-6mol·L-1，充分混勻后測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果如表2所示。由表2可知，該法測(cè)量氟離子的精確度較好，回收率分別為102.44%，100.67%和100.95%，可以用來檢測(cè)樣品中的氟離子。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素作為熒光探針對(duì)氟離子具有較好的選擇性。由于氟離子的加入破壞了槲皮素DMSO溶液的氫鍵，促使槲皮素分子內(nèi)的電荷重新分配，發(fā)生熒光猝滅。由熒光滴定光譜得到氟離子的滴定曲線，該曲線線性關(guān)系良好，可以用于對(duì)微量氟離子的定量檢測(cè)。該方法有望應(yīng)用于生物體內(nèi)和環(huán)境中氟離子的檢測(cè)。

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(Received Oct. 18, 2015; accepted Jan. 29, 2016)

*Corresponding author

A Quercetin-Based Fluorescent Probe for the Recognition of Fluorid Ions

YANG Shi-long1, 2, JIANG Wei-na1, 2, YIN Bin3, XU Li2, 3, 4*, ZHAO Feng-yi2, 5, GAO Bu-hong4, SUN Hai-jun4,DU Li-ting4, TANG Ying4, 5, CAO Fu-liang2, 5

1. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 2. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 3. College of Science, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 4. Advanced Analysis and Testing Center, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 5. College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

Quercetin；Fluorescent sensor; Fluorid ions; Anions; Natural product

2015-10-18，

2016-01-29

國(guó)家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(20120460102), 江蘇省第四期“333高層次人才培養(yǎng)工程”科研項(xiàng)目(BRA2012171), 國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題項(xiàng)目(2012BAD21B04)和南京林業(yè)大學(xué)優(yōu)秀博士學(xué)位論文創(chuàng)新基金項(xiàng)目資助

楊世龍，1989年生，南京林業(yè)大學(xué)博士研究生 e-mail: yshl6072@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail： xuliqby@njfu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)11-3582-06