劉　麗，楊曉慧，王瑞明

(齊魯工業(yè)大學 生物工程學院，濟南　250353)

飼喂硬脂酸和癸酸對工蜂合成10-HDA的影響

劉麗，楊曉慧，王瑞明

(齊魯工業(yè)大學 生物工程學院，濟南250353)

為探討硬脂酸和癸酸對工蜂合成10-HDA及其生物合成相關(guān)酶基因表達的影響，在工蜂基礎日糧中添加不同質(zhì)量分數(shù)的硬脂酸和癸酸，采用高效液相色譜法和半定量RT-PCR技術(shù)測定不同日齡段工蜂上顎腺10-HDA的合成量和相關(guān)酶基因的表達量。結(jié)果顯示，工蜂日糧中添加不同質(zhì)量分數(shù)的硬脂酸和癸酸可在一定程度上提高工蜂上顎腺10-HDA的產(chǎn)量，在工蜂5、10、15日齡時，w=5%硬脂酸組和w=1%癸酸組10-HDA的合成量均顯著高于空白組(P<0.05)，且全期10-HDA產(chǎn)量的平均值分別較空白組提高11.82%和13.37%。另外，w=5%硬脂酸組和w=1%癸酸組能使工蜂上顎腺10-HDA的分泌高峰提前，由原來的20日齡分別提前至15日齡和10日齡。同時，添加硬脂酸和癸酸后，工蜂在15日齡前的ETF-β和KAT基因表達量均增加。表明，硬脂酸和癸酸可影響工蜂10-HDA生物合成相關(guān)酶基因的表達，促進工蜂上顎腺合成10-HDA，在短時間內(nèi)提高10-HDA的產(chǎn)量。

硬脂酸；癸酸；10-HDA；ETF-β；KAT；高效液相色譜

10- 羥基-2癸烯酸(10-Hydroxy-2-Decenoic acid，10-HDA)是由工蜂上顎腺分泌的一種不飽和脂肪酸，是蜂王漿的高效生物活性物質(zhì)[1]。研究表明，10-HDA具有增強免疫力[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]等多種生理功能。

目前，國內(nèi)主要采用物理提取法、化學合成法及選育高產(chǎn)10-HDA的蜜蜂品種來提高10-HDA的產(chǎn)量。但這3種途徑均存在一定的缺陷，前2種方法工藝繁瑣，收率低，第3種方法選育周期較長。Plettner等[5-7]采用穩(wěn)定同位素氘(D)標記的方法發(fā)現(xiàn)，10-HDA生物合成的起始物質(zhì)是硬脂酸，隨后硬脂酸在ω端發(fā)生羥基化，生成ω-羥基硬脂酸，再通過脂肪酸β氧化，碳鏈縮短形成10碳的碳鏈，這一發(fā)現(xiàn)為研究10-HDA合成途徑開辟了道路。另有報道[5]指出，工蜂上顎腺可以利用簡單脂肪酸合成硬脂酸。因此，本研究擬從10-HDA合成途徑[8]入手，在工蜂基礎日糧中添加10-HDA合成前體，促進工蜂上顎腺10-HDA的合成，提高10-HDA產(chǎn)量。在10-HDA生物合成體系中存在多種酶的催化作用，前期已有研究通過蛋白質(zhì)組學的方法鑒定出與10-HDA生物合成相關(guān)的酶-電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β(Electron transfer flavoprotein subunit beta-like，ETF-β，又稱輔酶Q氧化還原酶)和3-酮酯酰CoA硫解酶(3-KetoacyI-CoA Thioase，KAT)，發(fā)現(xiàn)ETF-β為脫氫酶的電子受體，通過ETF脫氫酶可將電子轉(zhuǎn)移給主要的呼吸鏈，參與脂肪酸β氧化過程[9]。而KAT催化脂肪酸β-氧化循環(huán)中的硫解反應，與脂質(zhì)的合成、降解及能量產(chǎn)生有關(guān)[10-11]。因此，ETF-β與KAT在10-HDA生物合成中起重要作用。

本研究以當?shù)伛Z化的意大利工蜂為材料，在工蜂基礎日糧中添加不同質(zhì)量分數(shù)的硬脂酸和癸酸，檢測添加外源物質(zhì)對工蜂合成10-HDA及10-HDA生物合成相關(guān)酶基因表達的影響，以期為進一步完善10-HDA生物合成途徑，提高10-HDA產(chǎn)量奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1蜂群剛出房(時間不超過6 h)的意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)蜂群，由山東師范大學西門蜂場提供，蜂群活動正常。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2試劑硬脂酸(w≥99%，天津市凱通化學試劑有限公司)，癸酸(w≥98.5%，國藥集團化學試劑有限公司)，無水乙醇(色譜純，天津市富宇精細化工有限公司)；鹽酸(色譜純，天津市大茂化學試劑廠)；甲醇(色譜純，天津市大茂化學試劑廠)；10-HDA標準品(w≥98%，Adamas Reagent)，2×TaqPCR MasterMix(北京艾德萊生物科技有限公司)，UNIQ柱式Trizol總RNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.3主要儀器2720 Thermal型PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)，5804R型高速冷凍離心機(Eppendorf艾本德中國有限公司)，F(xiàn)A124S型電子天平(杭州匯爾儀器設備有限公司)，島津高效液相色譜儀(色譜柱：4.6 mm×250 mm的不銹鋼柱，填充物不定形硅膠C18鍵合相，孔徑10 μm)，ChampGel5500凝膠成像系統(tǒng)( 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

1.2方 法

1.2.1花粉飼料的配制于9月中旬進行，該時期無外界蜜粉源，意大利蜜蜂主要以人工飼喂基礎日糧為食?；A日糧由25 g蔗糖、25 g花粉、20 g脫脂豆粉和20 mL水組成[12]。在基礎日糧中分別添加w=1%、5%、10%的硬脂酸和w=1%、2.5%、5%的癸酸，飼喂蜜蜂。

1.2.2工蜂的標記與采集挑選7組蜂群勢力相當?shù)姆湎?，每箱隨機挑選500只剛出房的幼蜂，在其背部用記號筆作標記，記為0日齡，放回原蜂箱。隨機選擇1箱飼喂基礎日糧，作為空白組，另外6箱分別飼喂含不同質(zhì)量分數(shù)硬脂酸和癸酸的飼料，連續(xù)飼喂蜜蜂，并于標記后每隔5 d采集相應日齡的標記蜂。

1.2.3標記蜂的處理將采集到的標記蜂分為兩部分，一部分分成5組，每組5只，即5個平行，剪下其頭部，置于盛放少量甲醇的勻漿器中充分研磨，將研磨液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，定容至刻度并搖勻，經(jīng)0.22 μm纖維素酯微孔濾膜過濾，即獲得工蜂頭部10-HDA樣品溶液。另一部分標記蜂每9只1組，對其頭部進行解剖，獲取上顎腺，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為半定量RT-PCR的模板。

1.2.4工蜂上顎腺10-HDA的測定分別吸取0.02、0.05、0.125、0.313、0.781、1.953 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的 10-HDA標準母液移至25 mL容量瓶(即獲得0.8、2、5、12.5、31.25、78.125 mg/L 10-HDA)，甲醇定容并搖勻，0.22 μm纖維素酯微孔濾膜過濾，即得標準品溶液。采用高效液相色譜法[13]測定標準品的質(zhì)量濃度，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線，計算樣品溶液中10-HDA質(zhì)量濃度。色譜檢測條件：波長212 nm；流動相由V(甲醇)∶V(0.01 mol/L 鹽酸)∶V(超純水)=55∶10∶35組成；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫25 ℃。

1.2.5半定量RT-PCR檢測ETF-β和KAT基因的表達量半定量RT-PCR主要用于確定目的基因的mRNA表達量。通常以管家基因為參照，以等量的cDNA為模板，通過特異性引物進行PCR擴增獲得目的基因和管家基因片段。由于不同目的基因或不同組織來源的同一基因的表達量不同，在同一PCR體系條件下擴增得到的產(chǎn)物也不同，而管家基因的表達量相同。采用灰度掃描軟件確定灰度值，計算目的基因與管家基因PCR產(chǎn)物灰度值的比值，比較目的基因的表達水平。

根據(jù)NCBI發(fā)表的ETF-β(登錄號：571558662)、KAT(登錄號：571554458)、β-actin(登錄號：297591984) 基因序列，采用Premier 5軟件分別設計引物，擴增目的片段大小分別為505、506、182 bp。所用引物序列見表1。

表1　半定量RT-PCR引物序列

管家基因β-actin反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，擴增27個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。ETF-β、KAT基因PCR擴增的退火溫度均為60 ℃，28個循環(huán)，其他條件與β-actin基因相同。

通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并通過凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，采用Quantity One軟件進行灰度值分析，根據(jù)目的基因與管家基因PCR產(chǎn)物灰度值的比值，判斷靶基因的表達情況。

2結(jié)果與分析

2.1飼喂硬脂酸對工蜂合成10-HDA的影響

硬脂酸是蜜蜂上顎腺10-HDA合成的起始物質(zhì)，可作為外源性物質(zhì)直接被蜜蜂上顎腺利用。由圖1可知，與空白組相比，花粉飼料中添加w=1%、5%、10%的硬脂酸可提高15日齡前工蜂上顎腺10-HDA的分泌量，且w=5%硬脂酸作用效果顯著(P<0.05)，在5、10、15日齡10-HDA分泌量分別提高84.65%、26.65%和56.66%，全期10-HDA的產(chǎn)量平均值比基礎日糧組提高11.82%，說明w=5%硬脂酸更有利于工蜂10-HDA的合成。并且添加硬脂酸后，10-HDA的分泌高峰提前，由原來的20日齡提前至15日齡，表明，在花粉飼料中添加相應質(zhì)量分數(shù)的硬脂酸，能促進10-HDA合成，在短時間內(nèi)提高蜂王漿中10-HDA的產(chǎn)量。

圖中數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標準差”；單星號表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

Data are “mean ± SD”, and single asterisks indicate statistical significance atP< 0.05. The same in Fig. 2.

圖1飼喂硬脂酸后工蜂合成10-HDA的產(chǎn)量

Fig.1Effect of stearic acid on 10-HDA

synthesis in worker bees

2.2飼喂癸酸對工蜂合成10-HDA的影響

由圖2可知，與空白組比較，w=1%、2.5%、5%的癸酸組均能提高15日齡前工蜂上顎腺10-HDA的分泌量。其中，在10日齡時，w=1%癸酸組的工蜂頭部10-HDA合成量達到最大值，為每只54.31 μg；在15日齡時，w=2.5%、5%癸酸組的工蜂頭部10-HDA合成量達到最大值。由圖2還可以看出，添加w=1%癸酸的作用效果更顯著，該組在5、10、15日齡工蜂頭部10-HDA的合成量均顯著高于空白組(P<0.05)，10-HDA分泌高峰提前至10日齡，且全期10-HDA產(chǎn)量的平均值較空白組提高13.37%。15日齡后，與相應日齡段空白組相比，除w=1%硬脂酸組在30日齡時，工蜂10-HDA的合成量增加5.58%外，其他各組的10-HDA合成量均降低，其中，w=1% 癸酸組工蜂在20、25日齡時10-HDA的合成量分別下降29.24%、10.54%，w=2.5%癸酸組工蜂在20、25、30日齡時的合成量分別下降21.69%、18.56%、8.5%，w=5%癸酸組則分別下降40.76%、4.97%、8.84%，表明，后期癸酸無法促進工蜂高效合成10-HDA。

圖2　飼喂癸酸后工蜂合成10-HDA的產(chǎn)量

2.3飼喂硬脂酸對ETF-β和KAT基因表達的影響

為研究飼喂硬脂酸對10-HDA合成相關(guān)酶基因表達的影響，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測工蜂上顎腺ETF-β和KAT基因表達水平的變化。由圖3和圖4可知，空白組ETF-β和KAT基因的表達量均隨日齡的增加而增加，且在20日齡時表達量最高。而在基礎日糧中添加w=5%硬脂酸后，5、10、15日齡工蜂ETF-β和KAT基因的表達量均高于空白組，且這2個基因的表達高峰由原來的20日齡分別提前至15日齡與10日齡。表明，添加硬脂酸能增加10-HDA生物合成相關(guān)酶基因的表達，從而提高10-HDA的產(chǎn)量。

單星號表示差異顯著(P<0.05)，雙星號表示差異極顯著(P<0.01)。圖4、圖5、圖6同。

Single asterisks indicate statistical significance atP<0.05 and double asterisks indicate statistical significance atP< 0.01. The same for Fig.4, Fig.5, Fig.6.

圖3w=5%硬脂酸對ETF-β基因表達的影響

Fig.3Effect ofw=5% stearic acid on the

expression ofETF-βgene

圖4　w=5%硬脂酸對KAT基因表達的影響

2.4飼喂癸酸對ETF-β和KAT基因表達的影響

由圖2可知，w=1%的癸酸飼料比w=2.5%、5%的癸酸飼料更利于促進工蜂腺體10-HDA的合成。因此，選擇w=1%癸酸，分析其對10-HDA合成相關(guān)酶基因ETF-β及KAT表達水平的影響。由圖5和圖6可知，空白組中ETF-β和KAT基因表達量均隨日齡的增加而增加，在20日齡時，表達量達到最高。在飼料中添加w=1%癸酸后，10、15日齡工蜂ETF-β和KAT基因的表達量均顯著高于空白組(P<0.05)，且這2個基因的表達高峰由原來的20日齡分別提前至15日齡與10日齡。表明，在花粉飼料中添加w=1%癸酸后，能增加10-HDA生物合成相關(guān)酶基因ETF-β及KAT的表達，進而提高10-HDA的產(chǎn)量。

圖5　w=1%癸酸對ETF-β基因表達的影響

圖6　w=1%癸酸對KAT基因表達的影響

3結(jié)論與討論

本研究主要在工蜂基礎日糧中添加不同質(zhì)量分數(shù)的硬脂酸和癸酸，采用高效液相色譜法測定不同日齡段工蜂上顎腺中10-HDA的產(chǎn)量，以分析外源添加物質(zhì)對工蜂合成10-HDA的影響。同時，采用半定量RT-PCR技術(shù)分析硬脂酸和癸酸對10-HDA生物合成相關(guān)酶基因表達的影響，結(jié)果顯示，與空白組相比，15日齡前，在花粉飼料中添加w=5%硬脂酸、w=1%癸酸均能有效提高工蜂上顎腺10-HDA的產(chǎn)量(P<0.05)，且能使10-HDA分泌高峰提前，由原來的20日齡分別提前至15日齡和10日齡。另外，添加硬脂酸和癸酸均可使工蜂在15日齡前ETF-β和KAT基因的表達量增加，其增加趨勢與10-HDA在工蜂體內(nèi)合成量的增加趨勢基本一致。說明，外源硬脂酸和癸酸通過影響10-HDA生物合成相關(guān)酶ETF-β和KAT的基因表達來影響10-HDA的合成。

本研究顯示，硬脂酸及癸酸均可作為外源物質(zhì)被工蜂利用，提高10-HDA生物合成相關(guān)酶基因的表達，促進工蜂上顎腺10-HDA的合成。根據(jù)已有報道[10]，硬脂酸作為10-HDA合成的起始物質(zhì)，經(jīng)羥基化修飾及β氧化后最終生成10-HDA。因此，添加硬脂酸后，工蜂上顎腺10-HDA的合成量提高且參與脂肪酸β氧化的相關(guān)酶表達量也相應增加。另外，添加癸酸后，10-HDA的合成量提高，脂肪酸β氧化酶的表達量也增加。因此，推測癸酸可能通過增加碳鏈先合成硬脂酸，再進一步轉(zhuǎn)化生成10-HDA，但具體的分子調(diào)控過程還需進一步研究。

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Effects of Feeding Stearic Acids and Decanoic Acids on 10-HDA Synthesis in Worker Honeybee

LIU Li, YANG Xiaohui and WANG Ruiming

(School of Bioengineering,Qilu University of Technology, Jinan250353, China)

To investigate the influence of stearic acids and decanoic acids on the synthesis of 10-HDA and the expression of genes related to the biosynthesis in worker honeybee, 10-HDA production and the related gene mRNA levels were detected by adding different mass fraction of stearic acids and decanoic acids into the pollen feed from the feeding point of view. HPLC and semi-quantitative RT-PCR were used separately in the experiment. The results showed that adding different mass fraction of stearic acids and decanoic acids in the pollen feed could improve the synthesis of 10-HDA to a certain extent, in which the groups ofw=5% stearic acids andw=1% decanoic acids had significant effect on the synthesis of 10-HDA (P<0.05) relative to the control groups for the bees in 5, 10, 15 day old. And compared with the blank group, the average productions of 10-HDA were increased by 11.82%, 13.37% respectively in the whole period. In addition, with addition ofw=5% stearic acids andw=1% decanoic acids in the pollen feed, the 10-HDA secretion peak of worker bees was changed respectively from the original 20 days to 15 days and 10 days of age in advance. Meanwhile,ETF-βandKATmRNA levels were up-regulated by feeding the pollen with exogenous substances before 15 days of worker honeybee. In conclusion, stearic acids and decanoic acids could up-regulate the expressions ofETF-βandKATby which promote the synthesis 10-HDA synthesis and increase the yield of 10-HDA in a short time.

Stearic acid;Decanoic acid;10-HDA;ETF-β;KAT; HPLC

2015-12-21

2016-01-22

The National Natural Science Foundation of China (No.31201281 and 31171727); Shandong Province Young Scientist Research Award Fund Scheme (No. BS2013SW029).

LIU Li, female,master student. Research area: microbial enzyme technology. E-mail: liuli890216@163.com

WANG Ruiming, male, doctoral supervisor. Research area: microbial enzyme technology. E-mail: ruiming3k@163.com

(責任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

2015-12-21修回日期：2016-01-22

國家自然科學基金(31201281，31171727)；山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金計劃(BS2013SW029)。

劉麗，女，碩士研究生，研究方向為微生物酶技術(shù)。E-mail：liuli890216@163.com

王瑞明，男，博士生導師，研究方向為微生物酶技術(shù)。E-mail：ruiming3k@163.com

S896.3

A

1004-1389(2016)07-0973-06

網(wǎng)絡出版日期：2016-06-30

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1624.008.html