程　亮

(青海省農林科學院植物保護研究所，青海省農業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，農業(yè)部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，西寧　810016)

燕麥鐮刀菌GD-2產除草活性物質的初步研究

程亮

(青海省農林科學院植物保護研究所，青海省農業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，農業(yè)部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，西寧810016)

為明確燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)中除草活性物質，以野燕麥種子為靶標，采用活性追蹤法，對燕麥鐮刀菌正丁醇萃取物進行活性成分分離和活性測定。正丁醇萃取液旋轉蒸發(fā)去溶劑后進行硅膠柱層析，以二氯甲烷和甲醇的混合液進行梯度洗脫，每50 mL收集為一個餾分，共收集到50個餾分。生物測定結果表明：以二氯甲烷和甲醇的體積比為20∶1的混合液，洗脫得到的餾分24～27對供試雜草野燕麥表現出較強的活性，其對野燕麥的除草抑制作用均為4級。合并餾分24～27，以二氯甲烷和甲醇的體積比為15∶1的混合液作為展開劑進行薄層層析(TLC)，通過生物測定結果表明，Rf值在0.47～0.58的活性條帶對野燕麥有較強的除草抑制活性，對野燕麥的除草抑制作用達到5級。HPLC分析發(fā)現，該活性條帶主要含有3個組分，最大吸收峰在260 nm，其保留時間分別為6.378、19.721和22.403 min。

燕麥鐮刀菌；除草活性；分離純化

野燕麥(AvenafatuaL.)是麥類田間一種分布廣泛的惡性雜草，與小麥形態(tài)相似，生長發(fā)育時期相近，難以防除，給作物生產帶來嚴重威脅。目前，人們一般使用化學農藥對野燕麥進行防除，但長期使用化學農藥導致諸如抗藥性增強、環(huán)境污染、生態(tài)破壞等一系列惡性問題[1]。因此，研究開發(fā)新型除草劑迫在眉睫。篩選和利用自然界微生物中具有生物活性的代謝產物，研究開發(fā)新型生物源除草劑，類同于化學合成除草劑，該類型除草劑因具有定向性、研制周期短、研發(fā)費用相對低廉等優(yōu)勢，所以更受到化學家們的重視。

目前，從土壤中分離的微生物所產活性化合物直接用作商品除草劑使用的是雙丙氨膦(bilanafos)，廣泛用于免耕地和果園防除1a生和多年生禾本科及闊葉雜草[2]。張?zhí)N等[3]報道從馬蜂腸道分離出的馬蜂腸道真菌(Amaranthusretroflexus)對反枝莧具有很好除草活性。薛章榮等[4]研究發(fā)現淺灰鏈霉菌CGMCC1370對闊葉雜草和部分禾本科雜草有很好的防除效果。Oleskevich等[5]從自然患病的懸鉤子屬(Rubusspp.)植株上分離的燕麥鐮刀菌產生的串珠鐮刀菌素(moniliformin)毒素對屬下不同的種有很好的除草效果。

鐮刀菌屬(Fusariumspp.)是一大類廣泛分布在土壤和植物體內的絲狀真菌，其中包含多種極具破壞性的植物致病真菌。鐮孢菌能夠產生單端孢霉烯、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮等真菌毒素(mycotoxin)和其他類型的次生代謝產物[6-7]。但鐮刀菌毒素不但能影響真菌對植物的侵染，而且對人和動物具有毒害作用[8]，所以開發(fā)此類生物除草劑應當對人畜的安全性進行測試。

本研究采用生物活性跟蹤分離方法，從燕麥鐮刀菌正丁醇提取物分離純化出活性成分，并對其抑制野燕麥種子萌發(fā)活性進行測試，旨在為開發(fā)高效、低毒、低殘留與環(huán)境友好的新型除草劑奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試菌株

燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum) GD-2菌株，采自青海貴德罹病的野燕麥植株，菌株保存于青海省農業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室。

1.2供試雜草

野燕麥(AvenafatuaL.)種子，采集青海省農科院試驗田自然成熟的種子。

1.3培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基用于病菌的保存和菌餅的制備；PD 培養(yǎng)基用于GD-2菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4試劑與儀器

正丁醇(分析純)，天津市百世化工有限公司；甲醇(分析純)，天津市北辰方正試劑廠；二氯甲烷(分析純)，上海廣諾化學科技有限公司；柱層析硅膠(300～400目)，山東煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；硅膠制備板(20 mm×20 mm)，山東煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司。甲醇(色譜純)，德國默克公司。

旋轉蒸發(fā)儀N-1100，埃朗科技國際貿易(上海)有限公司；真空泵SHZ-DIII，鄭州長城科工貿有限公司；高效液相色譜儀LC-10F，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.5除草活性物質的分離純化

將培養(yǎng)好的斜面種子接種于已消毒的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)144 h，得到發(fā)酵液30 L。將發(fā)酵液于5 000 r·min-1離心20 min，將沉淀部分用10 Lφ=80%丙酮浸泡過夜。冷凍離心去除沉淀，將上清液減壓旋轉濃縮去除丙酮，然后與發(fā)酵液合并。用等體積正丁醇萃取3次，合并正丁醇相濃縮蒸干，再用甲醇浸取2遍，過濾除去甲醇不溶物，真空濃縮除去甲醇，獲得粗品。

粗品經硅膠柱層析分離，以不同體積比的二氯甲烷和甲醇混合液作洗脫液，其體積比分別為20∶1(1 500 mL)、15∶1(800 mL)和3∶1(500 mL)的流動相進行洗脫，分部收集，根據生物活性跟蹤結果，將活性部分濃縮，得到淡黃色固體。用少量甲醇溶解，進行薄層層析(TLC)分離制備，展開液配比為二氯甲烷∶甲醇=15∶1，記錄除草活性物質條帶Rf值，將具有除草活性最高的條帶刮下，用無水甲醇浸泡過夜，過濾，濾液減壓濃縮至10 mL 左右，再用制備型高效液相色譜(HPLC)進一步分離純化(制備柱型號:COSMOSIL 5C18-MS-II，20 mm I.D. × 250 mm，日本半井公司，流動相為V(甲醇)∶V(水)=10∶90，流速16 mL ·min-1，檢測波長260 nm)。整個分離純化過程以除草活性為生物活性跟蹤。

1.6生物活性測定

硅膠柱層析分離所得餾分生物活性測定采用種子萌發(fā)抑制法。首先用φ=1%次氯酸鈉對野燕麥種子消毒3 min，然后用無菌水沖洗3次，室內晾干，備用。在d=6 cm 的培養(yǎng)皿中放入同皿底大小的雙層濾紙，滅菌后備用。在每皿中加入1 mL毒素稀釋液(為減少溶劑對種子萌發(fā)的影響，取粗毒素處理液0.5 mL均勻滴加到濾紙上，待濾紙完全干后再均勻滴加0.5 mL滅菌水)，在上述處理的培養(yǎng)皿中均勻擺放20粒雜草種子，置于光照12 h 、黑暗12 h ，25 ℃條件下培養(yǎng)，并以滅菌水作對照，每個處理重復4次，3 d后檢測種子萌發(fā)情況。

種子萌發(fā)標準以種子發(fā)芽長度超過種子長度計，種子萌發(fā)抑制率按下列公式計算。

種子萌發(fā)抑制率=(對照組種子萌發(fā)率-處理組種子萌發(fā)率)/對照組種子萌發(fā)率×100%

芽(根)長抑制率=[對照組平均芽(根)長-處理組平均芽(根)比]/對照組平均芽(根)長×100%

除草抑制作用分級標準如表1所示。

表1　除草抑制作用分級標準

TLC層析板生物活性測定方法：利用層析板將合并餾分在薄層板上展開后，以層析板為載體，將12 g/L的水瓊脂鋪于板上，厚約0.5～1 cm，待瓊脂凝固后，將野燕麥種子點種于瓊脂平板上，然后將瓊脂平板放在盛有少量水的塑料方盒中，并用小木棒將瓊脂板架起來，以防浸水，最后用封口膜密封保濕，放置在26～28 ℃溫箱中培養(yǎng)，96 h后檢查野燕麥種子萌發(fā)結果。

2結果與分析

2.1硅膠柱層析及薄層層析

將除草活性物質粗提物進行硅膠柱層析，以二氯甲烷和甲醇(體積比為20∶1、15∶1和3∶1)的混合液對其進行梯度洗脫，每50 mL收集為一個餾分，共收集到50個餾分。將所收集到的餾分分別用甲醇稀釋，利用種子萌發(fā)抑制法對野燕麥進行除草活性測定，結果表明柱層析后所得到的餾分都對野燕麥表現出不同程度的活性，其中餾分24～27對野燕麥的抑制作用達到4級，其余餾分活性較弱，如餾分31、餾分32對野燕麥的抑制作用為3級，餾分4、餾分5等對野燕麥的抑制作用為2級，餾分1、餾分2等對野燕麥的抑制作用為1級(表2)。

從圖1可以看出，TLC薄層板上除草活性物質條帶位置在Rf為0.47～0.58之間，對野燕麥種子萌發(fā)有很強的抑制作用，胚芽和胚根伸長被很好的抑制，TLC薄層板上Rf大于0.58的物質條帶，除草活性次之，對野燕麥種子萌發(fā)有弱的抑制作用，Rf小于0.47的物質條帶，除草活性最弱，對野燕麥種子萌發(fā)無抑制作用。

表2　柱層析所得餾分的除草活性

圖1　餾分24～27合并生物測定結果

2.2 除草活性條帶的HPLC分析

將制備TLC薄層板上得到的具有較強除草活性的條帶轉溶于甲醇中進行HPLC分析。圖2為活性條帶的HPLC分析圖，可見該條帶主要包含3個組分，其保留時間分別為6.378、19.721和22.403 min，分別標記為組分1、組分2和組分3，分別將3個組分進行收集制備，利用種子萌發(fā)抑制法測定其對野燕麥的活性(圖3 為3個組分處理3 d的癥狀)，可見3個組分都表現不同程度的除草活性，其中組分2對野燕麥的根長抑制率達到91.37%，芽長抑制率為78.82%，組分1對野燕麥的芽長抑制率為81.18%，根長抑制率為85.49%，組分3對野燕麥的芽長抑制率為80.58%，根長抑制率為83.53%。

圖2　活性條帶的HPLC分析

圖3　活性條帶各組分對野燕麥的活性

3討 論

近年來，研究雜草病原真菌代謝產物的毒素物質，以尋找新的天然除草劑化合物或為仿生合成新型除草劑提供依據，已成為農田雜草生物防治研究的熱點之一。迄今為止，已報道有近20 屬真菌的 100 余種代謝產物具有較強的除草活性并具有開發(fā)為除草劑的潛力，研究報道最多的產生除草活性毒素的植物病原真菌，主要來自鏈格孢菌屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、刺盤孢菌屬(Colletotrichum)等。如Chen 等[9]從紫莖澤蘭葉斑病菌(Alternariaalternata)分離到AAC毒素，可顯著抑制紫莖澤蘭的光合電子傳遞；高松梅等[10]從瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum) PAC菌株的代謝產物分離到對馬唐有較強抑制作用的除草活性組分；Jiang等[11]從畫眉草彎孢霉(Curvulariaeragrostidis) QZ-2000菌株的代謝產物分離到對馬唐種子的幼根幼芽生長表現出明顯抑制作用的化合物α,β-dehydrocurvularin；鄭蒙等[12]從灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)誘變菌株BC7-3的代謝產物中分離到對馬唐具有很強除草活性的化合物10-順-二氫化灰霉二醛(10-syn-dihydrobotrydial)。Vikrant等[13]從莖點霉(Phomaherbarum)的代謝產物中分離到對銀膠菊具有很強活性的3-硝基鄰苯二甲酸。

已往研究曾采用薄層層析分離天然除草活性物質[14-15]，但該方法上樣量小，分離組分用于生測后難以有足夠的量進行第2 次分離。本試驗選用硅膠作固定相，二氯甲烷和甲醇混合溶劑作洗脫劑，對除草活性物質進行柱層析，取得較好的分離效果，說明此方法對燕麥鐮刀菌除草活性物質進行粗分是可行的。采用活性跟蹤方法，對獲得的餾分進行逐步分離純化。首先采用水瓊脂平板法，確定薄層板上的除草活性條帶區(qū)域的Rf值范圍，刮板后達到進一步去除非除草活性物質的目的。后期HPLC分析制備獲得的除草活性組分的量比較少，生物活性測定采用容器直徑較小的瓶蓋。HPLC 分析結果顯示雖然得到3個組分，但從分析結果圖上看，組分2 和3 兩個保留時間的峰很接近，即組分2為19.721 min，組分3為22.403 min，這2個組分尚未完全分開，這2個峰可能是難分離物質對或者可能由多個異構體組成，如果將其收集起來并進一步進行HPLC分離，可能會得到更好的分離效果。

本研究僅分離高活性餾分段的除草活性化合物，其他餾分段也具有一定的除草活性，因此，有必要對這些餾分段繼續(xù)分離。此外，本研究僅僅對正丁醇提取的活性物質進行分離，尚未對其他有機溶劑(乙酸乙酯、石油醚等)萃取物中的活性物質進行分離，有必要對其進一步研究。

本研究從燕麥鐮刀菌GD-2代謝產物中獲得3個組分，這幾個組分對野燕麥種子萌芽均具有很好的抑制活性，是GD-2具有除草活性物質的基礎。因此，GD-2具有開發(fā)為微生物除草劑的潛力，值得深入研究。

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The authorCHENG Liang, male, doctoral student. Research area:biological control of weed with pathogens. E-mail:liangcheng1979@163.com

(責任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

Primary Study of Herbicidal Active Metabolites fromFusariumavenaceumGD-2

CHENG Liang

(Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province,Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining of Ministry of Agriculture, Institute of Plant Protection,Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Science,Xining810016,China)

In order to study herbicidal substances ofFusariumavenaceumagainst wild oat,AvenafatuaL.seeds was used to screen herbicidal components from n-butanol extracts by bioassay. The n-butanol extracts were separated gradually by silica gel column using dichloromethane and methanol mixtures (V∶V=20∶1) as the developers. Eluents were collected in each 50 mL and 50 fractions were used for bioassay. The results revealed that fraction 24-27 showed strong activity againstAvenafatuaL. with the inhibition level of 4.The combined fractions of 24-27 were eluted with the mixture of dichloromethane and methanol (V∶V=15∶1) as the developer and active bands were collected. Bioassay results showed that the bands withRf0.47-0.58 had the stronger inhibitory activity againstAvenafatuaL. and the inhibition to weed reached four degree. HPLC analysis suggested that this fraction mainly contained 3 components and had the maximum absorption peak at 260 nm,the retention time of which was 6.378, 19.721 and 22.403 min respectively.

FusariumavenaceumGD-2；Herbicidal activity；Isolation and purification

2015-04-17

2015-07-21

National Natural Science Foundation of China (No. 30860165, 31160371); the “12th Five-year-Plan” National Science and Technology Support Program (No.2012BAD19B02); Youth Scientific Research Foundation of Qinghai University(No.2015-QNY-2)；Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of Ministry of Agriculture(No.201303022).

1004-1389(2016)07-1074-06

2015-04-17修回日期：2015-07-21

國家自然科學基金(30860165，31160371)；“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD19B02)；青海大學中青年科研基金(2015-QNY-2)；農業(yè)部公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303022)。

程亮，男，博士研究生，研究方向為雜草生物防治。E-mail:liangcheng1979@163.com

S482.4

A

網絡出版日期：2016-06-30

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1634.036.html