琚澤亮，趙桂琴，周向睿

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州　730070)

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燕麥Actin基因片段的克隆及序列分析

琚澤亮，趙桂琴，周向睿

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 克隆與分析燕麥肌動(dòng)蛋白基因片段.【方法】 根據(jù)其他植物Actin基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并性引物，以燕麥葉片總RNA為模板，采用RT-PCR的方法擴(kuò)增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞.陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序.【結(jié)果】 擴(kuò)增片段長(zhǎng)678 bp，共編碼225個(gè)氨基酸；所得序列與GenBank 中注冊(cè)的Actin基因序列的同源性均在85%以上，與其他肌動(dòng)蛋白的氨基酸序列的同源性達(dá)93%以上.【結(jié)論】 系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，擴(kuò)增到的燕麥肌動(dòng)蛋白基因與羊草、長(zhǎng)穗偃麥草和黑麥草等植物的肌動(dòng)蛋白基因親緣關(guān)系最為密切.

關(guān)鍵詞：燕麥；肌動(dòng)蛋白；序列分析；系統(tǒng)進(jìn)化分析

肌動(dòng)蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一種重要的古老蛋白質(zhì).在植物中，以肌動(dòng)蛋白和微管蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞骨架與質(zhì)膜相關(guān)或橫貫細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞分裂、分化、細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞壁的生物合成、共生現(xiàn)象、胞吞胞吐作用以及膜的循環(huán)利用等眾多生理過(guò)程，對(duì)生命體的進(jìn)化有著深遠(yuǎn)的影響[1-3].肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)緊密地聯(lián)系著其他重要的細(xì)胞器，發(fā)揮著不可替代的功能.作為管家基因，Actin在各種組織中表達(dá)恒定，是植物重要的內(nèi)標(biāo)參照之一，可用來(lái)比較來(lái)源不同的目的基因表達(dá)量的差異，以探明其他基因的表達(dá)模式及分子調(diào)控機(jī)制[4-5].同時(shí)，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上具有高度的保守性和同源性，這為研究不同物種之間的親緣關(guān)系和分化時(shí)間提供了有利條件[6-7].

目前已在許多谷物和牧草中克隆到了Actin基因，如玉米[8]、水稻[9-10]、谷子[11]、大豆[12]、花生[13]、蒙古冰草[14]、紫花苜蓿[15]等；對(duì)它的相關(guān)研究也在進(jìn)一步深入，如植物激動(dòng)蛋白異型體[16]、肌動(dòng)蛋白基因的功能[17]、肌動(dòng)蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌動(dòng)蛋白聚合解聚機(jī)制[18-19]、植物細(xì)胞動(dòng)態(tài)微絲骨架系統(tǒng)[20]等方面.

燕麥(Avenasativa)作為重要糧飼兼用作物，具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等優(yōu)良性狀，是西北高寒牧區(qū)主要的一年生飼料作物；由于其籽實(shí)含有較高的蛋白質(zhì)和脂肪以及水溶性纖維素，燕麥還是一種具有很高營(yíng)養(yǎng)及保健價(jià)值的禾谷類作物.目前，燕麥的分子生物學(xué)研究尚處于起步階段，基因組測(cè)序工作尚未完成，在對(duì)燕麥中很多有價(jià)值的基因進(jìn)行研究時(shí)需要有內(nèi)標(biāo)參照物.同時(shí)，植物肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)變化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中至關(guān)重要的一步反應(yīng)，來(lái)自多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白可通過(guò)直接作用于肌動(dòng)蛋白來(lái)改變細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)[18,21].這對(duì)燕麥眾多生理過(guò)程發(fā)生機(jī)制的研究有重要價(jià)值.但是有關(guān)燕麥Actin基因的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道.鑒于此，本研究以燕麥幼苗葉片為試驗(yàn)材料，采用近緣克隆的方法克隆燕麥Actin基因片段，并進(jìn)行序列分析，與其他高等植物肌動(dòng)蛋白基因的相似性進(jìn)行了比較，為燕麥分子生物學(xué)的后續(xù)研究打下基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植物材料為2周齡的‘隴燕3號(hào)’幼苗，種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供.采集新鮮材料的葉片用液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?

1.2試驗(yàn)試劑

UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、E.coliDH5α菌株、TaqDNA 聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、MgCl2、Maker 均購(gòu)自上海生工.其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3總RNA的提取

現(xiàn)在有一群熱心的家長(zhǎng)，他們組成班級(jí)家委會(huì)，定期為孩子們策劃實(shí)踐活動(dòng)。有的家長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)孩子缺乏閱讀興趣，就組織閱讀分享會(huì)，培養(yǎng)孩子的閱讀興趣。有的家長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)孩子的好詞好句積累貧乏，就組織了成語(yǔ)接龍大賽，激發(fā)孩子們積累好詞好句的熱情。五年級(jí)綜合性學(xué)習(xí)單元，遇到《遨游漢字王國(guó)》，家長(zhǎng)們便帶著孩子們走上街頭尋找錯(cuò)別字，并整理分析，撰寫(xiě)探究報(bào)告。每一場(chǎng)活動(dòng)對(duì)孩子們來(lái)說(shuō)都是一次學(xué)習(xí)的機(jī)遇，家長(zhǎng)就是這些機(jī)遇的制造者，為孩子們?cè)鎏碓S多實(shí)踐的機(jī)會(huì)，使孩子們?cè)趯?shí)踐中享受學(xué)習(xí)的樂(lè)趣。

參考UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行總RNA的提取，并根據(jù)實(shí)際情況稍作改進(jìn).用Gene Spec核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA 質(zhì)量濃度.將所得RNA樣品于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.4引物設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)對(duì)冰草(GQ457302)、大麥(AY145451)、黑麥草(AY014278)、黑米(AY212324) 、水稻(AY212324)、小麥(AB181991)、羊草(HM623326)等幾種近緣植物肌動(dòng)蛋白基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較分析，依據(jù)同源性高和簡(jiǎn)并性低的原則，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物P1、P2，用于擴(kuò)增燕麥Actin基因片段，推測(cè)目的片段的長(zhǎng)度為678 bp.引物由上海生工合成.P1：5′-GCGAATACCATATCTGTWTT-3′；P2：5′-TTCCTCCGAATCTCGACACT-3′；其中W=A、T.

1.5RT-PCR擴(kuò)增

cDNA 第一鏈的合成按照M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行.

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(2 mmol/L)5 μL、MgC12(25 mmol/L)3 μL，TaqDNA polymerase(5U/1 μL) 0.5 μL、P1(10 μmol/L) 1 μL、P2(10 μmol/L) 1 μL、cDNA 4 μL和30.5 μL無(wú)菌水，總體積為50 μL.反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.取10 μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)目的條帶.

1.6PCR產(chǎn)物的回收、轉(zhuǎn)化、鑒定與測(cè)序

1.7序列的生物信息學(xué)分析

使用NCBI在線分析軟件BLAST( www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 進(jìn)行同源性比較；序列的翻譯、分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建等在DNAMAN、MEGA4等生物軟件上進(jìn)行.

2結(jié)果與分析

2.1燕麥總RNA的提取

以燕麥幼嫩葉片為材料提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果(圖1)顯示，有3條明顯的條帶，28S rRNA的亮度約為18S rRNA的2倍，說(shuō)明RNA有較好的完整性.Gene Spec核酸檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果顯示A260/A280、A260/A230值均大于1.8，表明RNA純度較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn).

圖1　燕麥葉片總RNA的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of total RNAisolated from oat leaves

2.2RT-PCR 擴(kuò)增

用所得燕麥總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，獲得第一鏈cDNA后，用簡(jiǎn)并引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)680 bp處有1條條帶(圖2).該條帶大小與目的片段一致，且上下無(wú)雜帶，可能是目的片段，有待進(jìn)一步鑒定.

2.3陽(yáng)性克隆的篩選鑒定

將可能為目的基因的片段回收純化，然后與PUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選培養(yǎng).從轉(zhuǎn)化的平板上隨機(jī)挑取4個(gè)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的片段大小約為678 bp(圖3)，與RT-PCR結(jié)果一致，鑒定為陽(yáng)性克隆，將其送往上海生工進(jìn)行測(cè)序.

M：Marker ；1-2：PCR產(chǎn)物.圖2　燕麥Actin基因PCR產(chǎn)物Fig.2　PCR product of Actin from oat cDNA

M ：Marker；1-4：為陽(yáng)性克隆.圖3　陽(yáng)性克隆的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3　PCR identifying of positive clone

2.4測(cè)序結(jié)果及序列分析

將陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序，得到一段678 bp的cDNA序列，編碼225個(gè)氨基酸(圖4).將該基因片段與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核苷酸同源性比較分析，Blast結(jié)果顯示：該片段與其他肌動(dòng)蛋白基因的核酸序列同源性均很高，在85%以上.與小麥(GQ339780)和長(zhǎng)穗偃麥草(KF981729)的同源性為最高，達(dá)96%.氨基酸分析結(jié)果顯示同源性達(dá)93%以上.這證明了所得片段即為燕麥肌動(dòng)蛋白基因片段.將該基因命名為AsACT，同時(shí)將序列提交至GenBank，登錄號(hào)為KP257585.

根據(jù)GenBank中肌動(dòng)蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)推測(cè)出燕麥Actin基因的氨基酸序列片段，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行氨基酸多重比較.結(jié)果顯示其保守氨基酸為201個(gè)，非保守氨基酸為24個(gè)，表明克隆所得片段為肌動(dòng)蛋白基因的高度保守區(qū)域，也進(jìn)一步證實(shí)了肌動(dòng)蛋白是一種高度保守的蛋白.

下劃線為引物序列.圖4　燕麥Actin基因cDNA的核苷酸序列片段與推測(cè)的氨基酸序列Fig.4　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Actin from oat

2.5常見(jiàn)作物與牧草肌動(dòng)蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)Blast結(jié)果，選取我國(guó)常見(jiàn)的、同源性較高的作物與牧草，下載它們的肌動(dòng)蛋白序列，包括羊草(Leymuschinensis，ADK98519)、長(zhǎng)穗偃麥草(Lophopyrumelongatum，AHL58686)、黑麥草(Loliumperenne，AAG43040)、水稻(sativaJaponicaGroup，AAO62546)、黑米(sativaJaponicaGroup，AAO62546.1)、玉米(Zeamays，NP 001159156)、冰草(Agropyroncristatum，ACV71031)、大麥(Hordeumvulgare，AAN59956)、小米(Setariaitalica，AAG10041)、花生(Arachishypogaea，ABI79455)、黃豆(Glycinemax，ACU27913)、馬鈴薯(Solanumtuberosum，ACU27904)、豌豆(Pisumsativum，ACU27909)、紫花苜蓿(Medicagosativa，AFB83349)、油菜(Brassicanapus，AAD03741)、蒙古冰草(Agropyronmongolicum，ACL36421)和小麥(Triticumaestivum，BAD23897).用MEGA5.1生物軟件中的ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，然后采用Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)，參數(shù)為默認(rèn)值.

圖5　常見(jiàn)作物與牧草肌動(dòng)蛋白的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.5　Phylogenetic analysis of Actin proteins

結(jié)果表明，燕麥肌動(dòng)蛋白與羊草、長(zhǎng)穗偃麥草和黑麥草的親緣關(guān)系最為密切，其次為水稻、玉米等禾本科作物，它們處于同一個(gè)分支上.燕麥分為皮燕麥和裸燕麥兩種，本研究采用的‘隴燕3號(hào)’為皮燕麥，主要用作飼草，圖5顯示與其親緣關(guān)系最為密切的3種植物皆為牧草.同時(shí)，圖中還反映出系統(tǒng)分類學(xué)上同一科的植物，往往被聚類在一起，親緣關(guān)系較近，如豆科的豌豆、紫花苜蓿，禾本科的蒙古冰草和小麥.這些都暗示肌動(dòng)蛋白基因的進(jìn)化存在種屬特性，處于同種生態(tài)位的植物其功能基因在進(jìn)化中往往親緣關(guān)系密切.而茄科的馬鈴薯與豆科植物聚為一類，十字花科的油菜與禾本科植物聚為一類，體現(xiàn)了植物肌動(dòng)蛋白進(jìn)化的復(fù)雜性，這可能與該基因功能的復(fù)雜性有關(guān)[22].也進(jìn)一步證明了肌動(dòng)蛋白的高度保守性，對(duì)其完成眾多細(xì)胞功能、承受選擇壓力具有重要的生物學(xué)意義.

3討論

高等植物肌動(dòng)蛋白是單一多肽鏈的球狀蛋白，由375～377個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為42 ku，廣泛存在于植物的各種組織器官中.與其功能保守性相對(duì)應(yīng)的是其氨基酸序列具有高度的保守性和同源性[10].本研究所得序列與GenBank 中注冊(cè)的Actin 基因序列的同源性均在85%以上，與其他肌動(dòng)蛋白的氨基酸序列的同源性達(dá)93%以上，也再次證明了這一點(diǎn).蛋白質(zhì)進(jìn)化速率主要取決于功能上的需要或自然選擇壓力，而較少受氨基酸組成的影響[23].李園莉等[11]在比較了多種植物肌動(dòng)蛋白基因所編碼的氨基酸變化的位置和分布之后，提出肌動(dòng)蛋白氨基酸序列有大量更換替代，但是序列的親水、疏水特性有高度的相似性.這反映出肌動(dòng)蛋白在三級(jí)結(jié)構(gòu)上具有強(qiáng)烈的抗選擇壓力，為保障細(xì)胞生命活動(dòng)提供了堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[6]，也說(shuō)明了肌動(dòng)蛋白在植物生命活動(dòng)中功能的重要性.以植物肌動(dòng)蛋白為主形成的動(dòng)態(tài)微絲骨架系統(tǒng)已成為植物細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[20].本試驗(yàn)結(jié)果為燕麥肌動(dòng)蛋白后續(xù)功能研究提供了有力參考，豐富了燕麥細(xì)胞骨架領(lǐng)域的研究資料.

燕麥?zhǔn)且环N糧草兼用型1年生飼料作物，具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)草量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)[24].但是，燕麥的遺傳背景和分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)比較差，基因組測(cè)序尚未完成，在研究燕麥多種優(yōu)良抗逆基因及其他遺傳特性時(shí)需要一個(gè)良好的基因作為內(nèi)參[25].肌動(dòng)蛋白基因高度的保守性使其成為一種很好的植物基因研究?jī)?nèi)標(biāo)之一.本研究選取皮燕麥為材料，克隆到的肌動(dòng)蛋白基因全長(zhǎng)678 bp，序列長(zhǎng)度能夠滿足不同長(zhǎng)度擴(kuò)增片段引物設(shè)計(jì)、不同PCR反應(yīng)程序的需要，可為燕麥其他基因表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制的研究提供參考；同時(shí)，不足之處是未與裸燕麥做比較，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中.

肌動(dòng)蛋白是從分子水平研究生物系統(tǒng)進(jìn)化的一個(gè)很好的材料.本研究中，常見(jiàn)作物與牧草肌動(dòng)蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果反映了各植物間的親緣關(guān)系，使我們能夠了解各種生物進(jìn)化的進(jìn)程[11]，研究燕麥的起源與進(jìn)化，促進(jìn)作物種質(zhì)資源的科學(xué)利用與管理.由于植物肌動(dòng)蛋白基因成員組成的廣泛性和分化性，當(dāng)前已知的肌動(dòng)蛋白基因僅為植物肌動(dòng)蛋白家族的一部分，根據(jù)肌動(dòng)蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)還只是基因的分子進(jìn)化樹(shù)，雖然在區(qū)分親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種時(shí)具有一定的參考價(jià)值，但對(duì)親緣關(guān)系較近的物種則無(wú)法做出精確衡量.完善的物種進(jìn)化樹(shù)有待于今后更多肌動(dòng)蛋白基因的發(fā)現(xiàn)和系統(tǒng)進(jìn)化分析方法的改進(jìn)和完善[26-27].隨著研究的深入，越來(lái)越多的植物肌動(dòng)蛋白基因被克隆出來(lái)，對(duì)它的研究會(huì)更廣泛而深入，進(jìn)而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白基因在各種作物研究和改良上的應(yīng)用，為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收提供保障.

4結(jié)論

采用RT-PCR的方法進(jìn)行燕麥Actin基因片段的克隆.獲得了一段長(zhǎng)678 bp的燕麥肌動(dòng)蛋白cDNA序列，編碼225個(gè)氨基酸；所得序列與GenBank 中注冊(cè)的Actin基因序列的同源性均在85%以上，與其他肌動(dòng)蛋白的氨基酸序列的同源性達(dá)93%以上.系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示其與羊草、長(zhǎng)穗偃麥草和黑麥草等植物的肌動(dòng)蛋白基因親緣關(guān)系最為密切.

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(責(zé)任編輯趙曉倩)

Cloning and sequence analysis ofActingene fragment fromAvenasativa

JU Ze-liang,ZHAO Gui-qin,ZHOU Xiang-rui

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University，Key Laboratory of Grassland Ecology System,Ministry of Education,Sino-U.S.Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】To clone and analyze theActingene fromAvenasativa.【Method】 Degenerate primers were designed based on the conserved sequences of the actin genes from other plants.Total RNA was extracted from the leaves ofA.sativa.Actin gene fragment was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and cloned into PUCm-T vector.The positive clone identified by PCR was sequenced.【Result】 The amplified fragment fromA.sativacontains 678 bp,encoded a protein of 225 amino acids.Homology comparison with other plants actin gene sequences in the GenBank showed that it shared over 85% nucleotide sequence homology and 93% amino acid sequence homology with other plants actins.【Conclusion】Actingene ofA.sativahas an intimate genetic relationship withActingenes ofLeymuschinensis,LophopyrumelongatumandLoliumperenne.

Key words：Avenasativa;Actin;sequence analysis;phylogenetic analysis

通信作者：趙桂琴，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)椴莘N質(zhì)資源及育種.E-mail：zhaogq@gsau.edu.cn

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部牧草種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目(2013014)；甘肅高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2012009).

收稿日期：2015-03-17；修回日期：2015-04-21

中圖分類號(hào)：S 512.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2016)03-0037-06

第一作者：琚澤亮(1991-)，男，碩士，研究方向?yàn)椴莘N質(zhì)資源.E-mail：juzliang@126.com