張金麗， 曹雯娟， 熊喜峰， 劉志河

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實(shí)驗(yàn)研究

穗花杉雙黃酮調(diào)控人瘢痕成纖維細(xì)胞活性及凋亡的研究

張金麗， 曹雯娟， 熊喜峰， 劉志河

目的 探討穗花杉雙黃酮調(diào)控人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長與凋亡的作用機(jī)制。方法 將細(xì)胞接種于24孔板，分別加入不同濃度的穗花杉雙黃酮(0、25、50、100、150、200 μmol/L), 48 h后,酶標(biāo)儀檢測(cè)490波長的吸光度。選取濃度為50 μmol/L和100 μmol/L的穗花杉雙黃酮作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的用藥濃度，以0 μmol/L穗花杉雙黃酮為對(duì)照，加入到人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中作用48 h，分別采用DAPI染色檢測(cè)穗花杉雙黃酮對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的作用， Western blot檢測(cè)穗花杉雙黃酮對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞磷酸化AKT(p-AKT)及凋亡相關(guān)蛋白，如翻譯控制腫瘤蛋白、BAX、caspase 3、caspase 8、caspase 9的影響。結(jié)果 穗花杉雙黃酮對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的活力具有劑量依賴性抑制作用，穗花杉雙黃酮濃度為50 μmol/L以上與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DAPI染色顯示，穗花杉雙黃酮具有誘導(dǎo)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，加藥組細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核深染、核膜皺縮、有凋亡小體形成。Westernblot顯示，與對(duì)照組相比，AKT磷酸化水平降低；促凋亡蛋白BAX表達(dá)升高；抗凋亡蛋白TCTP表達(dá)降低；caspase3、caspase8、caspase9表達(dá)升高。結(jié)論 穗花杉雙黃酮可誘導(dǎo)瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，抑制其活力，有望成為臨床治療增生性瘢痕的一種有效藥物。

增生性瘢痕； 成纖維細(xì)胞； 凋亡； 穗花杉雙黃酮； 實(shí)驗(yàn)研究

增生性瘢痕是燒傷患者受傷后傷口修復(fù)過程中常見的并發(fā)癥。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，傷后患者的生存率得到了很大的提高，但形成的增生性瘢痕卻嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和心理健康[1]。增生性瘢痕是因成纖維細(xì)胞增殖生長失控、膠原過度沉積導(dǎo)致受傷部位異常愈合而形成，其中成纖維細(xì)胞的異常增殖在瘢痕的形成中起主要的作用[2]。目前，增生性瘢痕的治療仍以激素為主，同時(shí)還有5- 氟尿嘧啶、免疫調(diào)節(jié)劑等其他藥物，但治療效果各有利弊[3]。近年來，中草藥治療逐漸引起了人們的關(guān)注[4]。有研究證實(shí)，從卷柏中提取的穗花杉雙黃酮(amentoflavone, AF)具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種功效，且AF對(duì)UVB照射引起的正常皮膚成纖維細(xì)胞DNA損傷有保護(hù)作用[5-8]。自2014年6月至2015年3月，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所將AF作用于增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(hypertrophic scar fibroblasts, HSFBs)，以觀察其對(duì)HSFBs活力與凋亡的影響。

1 臨床資料

1.1 主要試劑 高糖DMEM、胎牛血清、胰酶及青鏈霉素(美國GIBCO公司);XTT(美國SIGMA公司);兔多克隆抗體TCTP、小鼠單克隆抗體BAX(美國SANTA CRUZE公司);兔單克隆抗體caspase 3、兔多克隆抗體caspsae 8、小鼠單克隆抗體caspase 9、兔單克隆抗體p-AKT(美國CST公司);DAPI染色封片劑(美國SANTA CRUZE公司);AF(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)。

1.2 組織來源 增生性瘢痕組織來源于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所需做手術(shù)切除的3例男性患者，年齡分別為4、7、45歲。均為創(chuàng)面愈合后5～12個(gè)月的增生期瘢痕，瘢痕高出皮膚表面。顏色鮮紅至暗紅，患者自覺偶有瘙癢感，無瘢痕潰瘍、破損、感染等情況，無合并腫瘤、糖尿病等基礎(chǔ)疾病。均獲患者的知情同意。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HSFBs的分離培養(yǎng) 采用組織塊培養(yǎng)法，將收集到的標(biāo)本用滅菌PBS液反復(fù)沖洗3次，去除瘢痕組織的表皮層和脂肪組織，然后將組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，接種于培養(yǎng)瓶中，添加含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞從組織塊中長出并接近融合成單層時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.2 XTT檢測(cè)AF對(duì)HSFBs活力的影響 取第3代生長旺盛的細(xì)胞接種于24孔板中,每孔接種3×104個(gè)細(xì)胞，次日，分別加入不同濃度的AF(0、25、50、100、150、200 μmol/L),每組3個(gè)復(fù)孔，48 h后加入XTT孵育4 h，放入酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

2.3 DAPI染色觀察AF對(duì)HSFBs凋亡的影響 取第3代細(xì)胞接種于已鋪有蓋玻片的六孔板中，每孔接種10萬個(gè)細(xì)胞，次日，分別加入不同濃度(0、50、100 μmol/L)AF，作用48 h后，PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定30 min,加入DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色并至熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)。

2.4 Western blot檢測(cè)AF對(duì)HSFBs蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，加入不同濃度AF(0、50、100 μmol/L)作用48 h后，棄上清，PBS洗3次，加入RIPA細(xì)胞蛋白裂解液，離心后收集上清測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，3%BSA封閉2 h，分別加入一抗(TCTP、BAX、caspase 3、caspase 8、caspase 9、p-AKT),4℃冰箱搖床孵育過夜，次日TBST洗3次，分別加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次后加入ECL發(fā)光液，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀顯影拍照。

3 結(jié)果

3.1 XTT檢測(cè)顯示AF抑制HSFBs的活力 當(dāng)AF濃度為50 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明AF對(duì)HSFBs的生長有抑制作用；隨著藥物濃度的增加，抑制作用越強(qiáng)(圖1)。

3.2AF對(duì)HSFBs凋亡的影響DAPI染色顯示，與對(duì)照組相比，50μmol/L與100μmol/LAF組細(xì)胞核變小、染色質(zhì)濃縮、核膜皺縮呈不規(guī)則樣、凋亡小體形成(圖2)。

3.3Westernblot檢測(cè)AF對(duì)HSFBs蛋白表達(dá)的影響Westernblot顯示，以對(duì)照組蛋白表達(dá)為100%，p-AKT和翻譯控制腫瘤蛋白的表達(dá)降低，在50、100μmol/LAF的作用下，p-AKT相對(duì)蛋白表達(dá)分別是(49.30±10.44)%和(54.00±10.69)%，抗凋亡蛋白翻譯控制腫瘤蛋白(translationallycontrolledtumorprotein,TCTP)相對(duì)蛋白表達(dá)為(70.00±17.00)%和(57.00±13.00)%(圖3，4)；與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。促凋亡蛋白BAX、caspase3、caspase8、caspase9表達(dá)升高，在50、100μmol/lAF作用下，蛋白表達(dá)分別為BAX：(120.00±36.00)%、(180.00±43.00)%；caspase3：(277.00±38.00)%、(387.00±55.00)%；caspase8：(213.00±20.00)%、(367.00±21.00)%；caspase9：(166.00±56.00)%、(266.00±71.00)%(圖5,6)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 討論

正常情況下，人體組織受傷后，傷口部位成纖維細(xì)胞的生長與凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積與消退始終維持著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，此動(dòng)態(tài)平衡是保證傷口正常愈合的關(guān)鍵。然而，在有些燒傷患者中，由于炎癥或其他因素的影響，導(dǎo)致傷口處成纖維細(xì)胞的異常增生、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而形成了增生性瘢痕。因此，抑制HSFBs的增生、誘導(dǎo)HSFBs的凋亡，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的分泌是治療增生性瘢痕的一個(gè)重要途徑。

本研究結(jié)果顯示，AF能夠劑量依賴性的抑制HSFBs的生長。AF具有抗炎的作用，能夠抑制多種炎癥因子如一氧化氮、前列腺素E2等的表達(dá)和釋放。黃振青等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AF能夠降低急性肝損傷大鼠血清中TNF-α、TGF-β1、IL-1β 和IL-6的含量，而且肝組織TNF-α和iNOS基因的表達(dá)也顯著下調(diào)。李巍等[10]研究表明，黃芩甙能夠通過抑制TGF-β1和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平減少細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積來影響皮膚瘢痕的形成。因此，AF很可能通過減少這些炎癥因子的生成而降低炎癥因子對(duì)HSFBs的生長刺激作用，從而抑制HSFBs的生長。此外，我們還通過DAPI染色觀察AF處理過的HSFBs細(xì)胞核形態(tài)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞核具有細(xì)胞凋亡的特征；Western blot檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)，AF能夠激活caspase 3、caspase 8、caspase 9蛋白酶從而誘導(dǎo)HSFBs凋亡。caspase 8可通過兩條平行通路促進(jìn)凋亡：一方面它可以直接剪切并激活caspase 3；另一方面它還可以切割Bid，截短的Bid進(jìn)入線粒體，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而激活caspase 9和caspase 3，而caspase 3是所有凋亡途徑的必經(jīng)之路。曾有文獻(xiàn)報(bào)道，AF可以增強(qiáng)細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑和抑癌基因p53的活性，通過下調(diào)細(xì)胞周期素等途徑，激活細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase 3 和caspase 9，通過線粒體固有途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。楊雨等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，AF可以通過影響caspase 3和β-catenin表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡。

圖1 不同濃度AF對(duì)HSFBs活力的影響 圖2 熒光顯微鏡下觀察HSFBs凋亡細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)特征(×400) a.對(duì)照組 b.50 μmol/L AF組 c.100 μmol/L AF組 圖3 Western blot檢測(cè)AF對(duì)HSFBs中p-AKT、BAX、TCTP蛋白表達(dá)的影響 圖4 p-AKT、BAX、TCTP蛋白表達(dá)半定量分析 圖5 Western blot檢測(cè)AF對(duì)HSFBs中caspase 8、caspase 9、caspsae 3蛋白表達(dá)的影響 圖6 caspase 8、caspase 9、caspsae 3蛋白表達(dá)半定量分析

Fig 1 Effect of different concentration AF on HSFBs vitality. Fig 2 Apoptotic features of HSFBs nuclear under fluorescence microscopy (×400). a. control group. b. 50 μmol/L AF group. c. 100 μmol/L AF group. Fig 3 Influence of AF on the expression of apoptosis-related protein in HSFBs examined by Western blot. Fig 4 Expression of p-AKT, BAX, TCTP proteins examined by semiquantitative analysis. Fig 5 Influence of AF on the expression of apoptosis protein in HSFBs examined by Western blot. Fig 6 Expression of caspase 8, caspase 9, caspsae 3 proteins examined by semiquantitative analysis.

細(xì)胞凋亡是一種受調(diào)節(jié)的細(xì)胞自殺機(jī)制，細(xì)胞凋亡的發(fā)生，一方面需要促凋亡因子的表達(dá)，另一方面則需要抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)。那么，在本研究中AF如何調(diào)控HSFBs凋亡的呢？我們分別檢測(cè)了BAX、TCTP及p-AKT的表達(dá)，AKT是生存信號(hào)傳導(dǎo)中一個(gè)重要因子，能夠被許多促生長因子活化，在維持細(xì)胞的存活與增殖方面起重要作用，當(dāng)AKT的活化被抑制以后，能夠阻斷許多促細(xì)胞生長、抗凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。其結(jié)果顯示，當(dāng)AF作用于HSFBs時(shí)，HSFBs的AKT磷酸化被抑制，而BAX表達(dá)升高，TCTP表達(dá)降低。BAX屬于一種促凋亡蛋白，當(dāng)BAX的表達(dá)升高時(shí)，可以募集并激活caspase 9，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。唐悅玲等[13]研究表明，腫瘤壞死因子α可通過調(diào)節(jié)瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)BAX的表達(dá)而誘導(dǎo)其凋亡。而TCTP具有抗凋亡作用。Rho 等[14]在肺癌細(xì)胞系人肺腺癌細(xì)胞(A549)中過表達(dá),TCTP能降低由p53 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而利用siRNA 干擾TCTP的表達(dá)則增加了細(xì)胞的凋亡。張飛等[15]發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細(xì)胞中異常高表達(dá)TCTP，可通過上調(diào)Bcl-xL抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，AF很可能是通過抑制AKT磷酸化、降低TCTP蛋白表達(dá)、促進(jìn)BAX升高，進(jìn)而激活caspase 8、caspase 9及caspase 3，從而抑制HSFBs生長并促進(jìn)其凋亡。

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Influence of Amentoflavone on the viability and apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts

ZHANGJin-li,CAOWen-juan,XIONGXi-feng,LIUZhi-he.

(InstituteofTraumaticSuigery,GuangzhouRedCrossHospital,MedicalCollageofJinanUniversity,Guangzhou510220,China)

LIUZhi-he,Email:zliu0731@163.com

Objective To investigate the effect of Amentoflavone (AF) on the viability and apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts (HSFBs) and its underlying mechanism. Methods XTT assay was performed to assess cell viability. HSFBs were seeded at 3.0×104cells/well in a 24-well plate overnight, and then treated with different concentrations of AF(0 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L, 200 μmol/L. After incubation for 48 h, cell absorbance was detected at 490 nm wavelength. In following experiments, 50 μmol/l AF and 100 μmol/l AF concentration was used. HSFBs were incubated with 50 μmol/L AF or 100 μmol/L AF or 0 μmol/L AF for 48 h. Cell apoptosis were examined by DAPI staining. Western blotting was used to analyze the expression of cell apoptosis-related proteins such as translationally controlled tumor protein (TCTP), BAX, caspsae 3, caspase 8, caspase 9, and p-AKT in HSFB treated with AF. Results AF can inhibit the viability of HSFB dose dependently. Comparing control group (AF: 0 μmol/L) with 50 μmol/L AF or higher AF groups, the difference in cell viability was significant (P<0.05).DAPIstainingshowedAF-inducedapoptosisinHSFBs.AFinducestypicalapoptoticfeaturessuchasmembraneblebbing,cellshrinkageanddetachment,nuclearcondensationandfragmentation.WesternblotshowedthattheexpressionofAKTphosphorylationandanti-apoptoticproteinTCTPwerelower,whiletheexpressionofpro-apoptoticproteinBAXandcaspase3,caspase8,caspase9werehighercomparedwiththecontrolgroup. Conclusion Amentoflavone could induce aptosis of scar fibroblasts so as to inhibit its activity which is expected to become effective medicine for hyperplastic scar treatment.

Hypertrophic scar; Fibroblast; Apoptosis; Amentoflavone; Experimental study

國家自然科學(xué)基金(81272222)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(20131A011038) 作者單位：510220 廣東 廣州，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院 創(chuàng)傷外科研究所 第一作者：張金麗(1979-)，女，河南人，主管技師，碩士研究生. 通信作者：劉志河，510220，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院 創(chuàng)傷外科研究所，電子信箱:zliu0731@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.03.018

R

A

1673-7040(2016)03-0173-04

2015-12-19)