張廣宇， 于冬梅， 羅 賽， 郝立君

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不同低溫條件保存的大鼠脂肪自體移植后成活率的探究

張廣宇， 于冬梅， 羅 賽， 郝立君

目的 探討在-80℃、-196℃低溫條件下儲存后的脂肪顆粒，在自體脂肪移植1、3個月后的移植成活率，并對移植物的組織學(xué)、活性等進(jìn)行檢測。方法 將實驗動物分組，獲取脂肪顆粒并處理，凍存3個月后，取出脂肪顆粒進(jìn)行檢測；然后制備動物模型，獲取移植物，對脂肪顆粒和脂肪移植物進(jìn)行組織學(xué)檢測，檢測脂肪顆粒及移植物顆粒的活性，并進(jìn)行葡萄糖轉(zhuǎn)移實驗等。結(jié)果 移植1個月后，移植物成活率新鮮脂肪組>-196℃組>-80℃組(P<0.05)。移植3個月后，新鮮脂肪組、-196℃組、-80℃組移植成活率相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.97)。-80℃組移植后1、3個月，脂肪顆?；钚詿o明顯差別；新鮮脂肪組、-196℃ 組移植后3個月,顆粒活性均大于其移植后1個月。其中以一196℃ 組增加更明顯。結(jié)論 -80℃、-196℃ 條件下，儲存的脂肪移植后較好地保持了體積和活性。-196℃存儲的脂肪在組織學(xué)和活性方面更接近于新鮮脂肪的移植效果。故短期內(nèi)，-80℃、-196℃儲存的脂肪滿足臨床脂肪重復(fù)注射的需求。

脂肪顆粒； 低溫保存； 自體移植； 成活率； 移植物活性

自2013年11月至2014年12月，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形美容中心以新鮮的大鼠脂肪顆粒注射作為對照，旨在探討兩種低溫保存方法對移植后移植物成活率的影響，以與傳統(tǒng)的即抽即用的方法做對比,明確凍存的脂肪顆粒短期內(nèi)在受區(qū)發(fā)生的變化，以便對未來臨床上應(yīng)用凍存脂肪顆粒移植時起到一定的借鑒作用。

1 實驗動物與分組

選擇雌性成年Waster大鼠36只(山東魯抗醫(yī)藥有限公司動物實驗中心提供)，體質(zhì)量為(240±10) g。將所有大鼠隨機(jī)分為3組，A組注射新鮮脂肪顆粒；B組注射-80℃下凍存3個月的脂肪顆粒；C組注射-196℃下凍存3個月的脂肪顆粒，每組12只。所有動物均以單籠飼養(yǎng)。

2 操作方法

2.1 脂肪顆粒的獲取與處理 實驗動物稱質(zhì)量后，以0.4 ml/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛，將大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)剃毛，碘伏消毒后，于雙側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)約0.5 cm處做長約1.0 cm的縱行切口，打開盆腔上肌層，抽出并切取腹股溝脂肪，止血后用3-0絲線分層縫合。將脂肪剪成大小約1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的顆粒，用20 ml注射器吸取脂肪顆粒和生理鹽水，沖洗3次，每只大鼠獲得純凈脂肪顆粒約1.5 ml，分成2份，1.0 ml用于脂肪注射，0.5 ml用于脂肪顆粒凍存后的檢測。將脂肪顆粒分別導(dǎo)入已標(biāo)記的3 ml凍存管中，每管中加入等體積的低溫保護(hù)劑混合液。迅速置于0℃冰水混合物中浸浴15 min，再轉(zhuǎn)入-80℃(深低溫冰箱)和-196℃(液氮)中保存。

2.2 檢測凍存3個月后的脂肪顆粒 將B、C組凍存的0.5 ml脂肪顆粒取出后迅速置于37℃水浴中快速晃動，約5 min完全解凍后，及時吸除低溫保護(hù)劑，以20 ml注射器抽取生理鹽水反復(fù)沖洗以避免低溫保護(hù)劑在常溫下對脂肪顆粒的毒害作用，待脂肪鹽水混合液中無明顯氣味和油滴后，每組取出6份0.5 ml脂肪用于葡萄糖轉(zhuǎn)移實驗。另外，每組取出6份用做組織學(xué)檢測。每組1.0 ml脂肪同法復(fù)蘇處理后，測量其質(zhì)量和體積后用于自體脂肪移植。

2.3 動物模型的制備 以相同方法獲取并處理A組脂肪顆粒，每只大鼠獲得約1.5 ml純凈脂肪顆粒，同樣分做2份按上述用途分配。將大鼠背部皮膚備皮消毒后，于背部中線兩側(cè)分別做長約0.4 cm切口，以眼科剪分離皮下各形成大小約0.4 cm×0.4 cm空隙，兩個空隙保持一定距離，分離時避免相通致脂肪融合，以1 ml注射器抽取0.5 ml脂肪接12號針頭按標(biāo)記分別注射于原脂肪來源大鼠皮下。以針尖蘸取亞甲藍(lán)在受區(qū)形成的皮丘周圍穿刺入皮下做標(biāo)記，以便于其后脂肪移植物的獲取。

2.4 移植物的獲取 分別于脂肪顆粒移植后的1、3個月取出移植物，每組隨機(jī)抽取6只大鼠，術(shù)區(qū)常規(guī)處理后，按術(shù)前標(biāo)記切口完整剝離出背部兩側(cè)移植物，可見有明顯的包膜包裹，有周圍組織分界清楚，置于生理鹽水中反復(fù)沖洗去除血液后以自制微刻度量筒測量體積并于電子天平稱質(zhì)量后，一側(cè)移植物用于組織學(xué)檢測，另一側(cè)移植物用于移植物活性的檢測。

2.5 脂肪顆粒和脂肪移植物的組織學(xué)檢測 將每組6份0.5 ml脂肪顆粒經(jīng)洗滌后，以濾紙包裹后放于包埋盒中，以4%中性甲醛固定24～48 h，脂肪移植物直接入甲醛固定。石蠟切片的制備：⑴脂肪從甲醛中取出后流水下沖洗約30 min。⑵脫水。⑶透明。⑷浸蠟。⑸包埋。⑹切片。⑺撈片。⑻烤片。蘇木素-伊紅染色：⑴石蠟切片常規(guī)脫蠟入水。⑵水洗。⑶蘇木素染色10 min。⑷充分水洗。⑸鹽酸乙醇分色。⑹水洗。⑺氨水藍(lán)化2～3 min。⑻充分水洗。⑼0.5%～1.0%伊紅染色0.5 min左右。⑽脫水透明。中性樹膠封片。免疫組化步驟：⑴石蠟切片常規(guī)脫蠟入水。⑵滴加去離子水雙氧水室溫下孵育約10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。⑶抗原修復(fù)。⑷滴加一抗，室溫中孵育1 h，PBS漂洗3次，每次2 min。⑸滴加試劑1。⑹滴加試劑2。⑺DAB顯色。⑻于蘇木素中染色5 min，分化液中浸數(shù)秒后，自來水洗凈，蘭化液中浸數(shù)秒后自來水洗凈。⑼于梯度乙醇中逐步脫水，擦干玻片后封片。

2.6 葡萄糖轉(zhuǎn)移實驗 將沖洗后的脂肪顆粒靜置后去除底層的生理鹽水和雜質(zhì)沉淀后，將每份0.3 ml脂肪顆粒置于無菌培養(yǎng)皿中，每組6個標(biāo)本，同時每組設(shè)置一個空白標(biāo)本，以3個空白標(biāo)本葡萄糖濃度的平均值作為基礎(chǔ)濃度。于每個培養(yǎng)皿中加入4.0 ml含低糖無血清的DMEM，同時加入8 μl正規(guī)胰島素，所有標(biāo)本搖均后置于37℃、5%CO2恒溫孵育箱中，孵育40 min后取出，抽取其中的澄清培養(yǎng)液體置于全自動生化分析儀中檢測DMEM中葡萄糖濃度。基礎(chǔ)濃度與每個樣本中葡萄糖濃度的差值即為該脂肪顆粒樣本的葡萄糖轉(zhuǎn)移量。葡萄糖轉(zhuǎn)移量的多少即代表脂肪顆?；钚缘母叩汀Ｒ浦参锶〕龊?，去除其中的結(jié)締組織后，剪碎成大小為1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的顆粒，以600 r/min離心后，取上層顆粒組織0.3 ml，同法進(jìn)行葡萄糖轉(zhuǎn)移實驗。

2.7 MTT法測定移植物顆粒的活性 將進(jìn)行葡萄糖轉(zhuǎn)移實驗后的移植物顆粒，經(jīng)PBS沖洗去除DMEM后，分別加入到離心管中，每管加入1 mg/ml Ⅰ型膠原酶0.6 ml孵育消化45 min后，250 r/min離心5 min，再加入PBS后震蕩，終止消化，靜置后每管中吸取出150 μl乳糜樣懸液置于EP管中，每管加入40 μl濃度5 mg/ml的MTT,置于37℃溫箱中反應(yīng)3 h，反應(yīng)完成后每管樣本中加入異丙醇100 μl，震蕩并低速離心30 s后加入葵花籽油，每管吸取50 μl上層藍(lán)紫色液體，注入96孔板中，每組樣本設(shè)置一空白孔，不添加脂肪顆粒而其他試劑及操作程序相同，同樣取上層液體50 μl，將96孔板置于酶聯(lián)免疫檢測儀內(nèi)，檢測在492 nm下各樣本的吸光度值(D492)。以3個空白孔的吸光度值平均值作為基礎(chǔ)值，各個樣本的吸光度值減去基礎(chǔ)值即為該樣本的活性值。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察 在-80℃、-196℃條件下儲存的脂肪顆粒未見脂滴液化、細(xì)胞破碎后纖維狀組織，與新鮮脂肪顆粒相比，除表面略暗缺少光澤外，并無其他差別。脂肪移植后1個月，A組移植物質(zhì)地為中等硬度，成紐扣狀彈性較好，表面可見到較多血管形成；B組、C組下脂肪移植物質(zhì)地較軟，表面也可見血管長如，外觀上無明顯差別(圖1)，脂肪移植后3個月，3組脂肪移植物均較軟，表面可見蜂窩狀結(jié)構(gòu)，B組較A、C組移植物表面略顯蒼白。A、C組間外觀上無明顯不同(圖2)。

3.2 體積分析 脂肪顆粒移植后3組體積在3個月內(nèi)隨時間延長體積逐漸縮小，各組數(shù)據(jù)經(jīng)獨立樣本的t檢驗其正態(tài)性后，均服從近似正態(tài)分布(表1)。

3.3 葡萄糖轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果分析 脂肪顆粒經(jīng)凍存3個月后，與新鮮脂肪顆?；钚韵啾?，B組、C組脂肪顆?；钚苑謩e達(dá)到62.5%、68.7%。兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2)。MTT實驗結(jié)果見表3。

3.4 微血管密度分析 微血管經(jīng)免疫組化處理后CD34附著于血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色，其微血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由棕黃色的兩個或更多的內(nèi)皮細(xì)胞圍成，其內(nèi)可見滲出的顆粒狀紅細(xì)胞，有的血管呈條索狀而無明顯的管腔或只見成團(tuán)的染色的內(nèi)皮細(xì)胞。我們以每個樣本3張切片在200倍顯微鏡下4個周邊區(qū)和1個中央?yún)^(qū)的平均微血管數(shù)量為該樣本的微血管密度值。3組在注射后3個月的微血管密度均大于同組注射后1個月的微血管，t檢驗分析，A組P=0.008，B組P=0.021，C組P=0.002，見表4。

3.5HE染色 注射前，3組脂肪顆粒在顯微鏡下觀察無明顯差異(圖3)。注射后1個月，新鮮組移植物鏡下可見少量完整的脂肪細(xì)胞多位于外周，大量脂肪壞死融合后形成的脂肪空泡位于中央?yún)^(qū)，多體積小，空泡間隔也較小，空泡周圍大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，3個月后炎癥細(xì)胞明顯減少，可見大量增生的血管，管腔擴(kuò)張充血。-80℃下存儲的脂肪顆粒移植1個月后，大小不等的脂肪空泡滿布視野，且脂肪空泡較大，可見密集的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及異物巨噬細(xì)胞增生。移植3個月后，可見大量邊界清晰的形狀不規(guī)則的脂肪大空泡。-196℃存儲脂肪顆粒移植1個月后，小脂肪空泡較多且較密集，移植3個月后可見體積較大的脂肪空泡主要集中在中央?yún)^(qū)，外周區(qū)可見大量密集排列的具有細(xì)胞核的完整脂肪細(xì)胞，細(xì)胞膜清晰，炎癥細(xì)胞罕見(圖4，5)。各組CD34染色結(jié)果可見(圖6，7)。

4 討論

-80℃、-196℃ 條件下儲存脂肪顆粒在移植后較好地維持了原注射脂肪的體積，均在40%以上。尤其是-196℃存儲的脂肪在移植后1個月平均達(dá)到原體積的51%，且在移植物活性方面更優(yōu)越于新鮮脂肪的注射效果。如果僅考慮注射的填充效果及體積因素，短期內(nèi)，-80℃、-196℃ 條件下儲存的脂肪顆粒滿足臨床脂肪重復(fù)注射的需求；-80℃、-196℃ 條件下凍存3個月后的脂肪顆粒較好地保持了脂肪顆粒的活性；-196℃ 組在脂肪移植3個月后，脂肪顆?；钚源笥?個月的活性。表明-196℃下凍存的脂肪顆粒適應(yīng)受區(qū)缺血、缺氧及炎癥反應(yīng)環(huán)境的能力強(qiáng)，長期注射后效果會較好；-80℃下存儲的脂肪顆粒移植后隨時間推移脂肪移植物成活率、活性變化較小，表明耐受受區(qū)環(huán)境的能力較差，可能由于其中促進(jìn)脂肪顆粒成活的活性因子減少或活性降低明顯，脂肪細(xì)胞增殖的能力下降。⑸脂肪移植后1個月，移植物在受區(qū)內(nèi)的炎癥反應(yīng)較重，脂肪細(xì)胞此時也是耐受缺血適應(yīng)受區(qū)環(huán)境的關(guān)鍵時期，脂肪細(xì)胞在這個時間內(nèi)破壞融合嚴(yán)重，表現(xiàn)在該時期的血管在炎癥作用血管擴(kuò)張、管腔擴(kuò)張、滲出較明顯及大量吞噬細(xì)胞吞噬壞死的脂肪細(xì)胞。這可能也是導(dǎo)致移植物顆粒活性的下降在該時期內(nèi)最明顯的原因。⑹移植后脂肪顆粒存活的首要是建立血供，通過外周血管長入或與原脂肪顆粒中的毛細(xì)血管完成對接來建立，因此，移植后脂肪細(xì)胞的存活及脂肪顆粒的活性與微血管的形成存在密切的相關(guān)性，而脂肪顆?；钚院玫难芤草^密集說明活性越高越利于血管的形成，而血管的形成又可促進(jìn)移植后脂肪移植物的存活。

表1 不同時期各組脂肪移植物的體積

組別移植前移植后1個月移植后3個月A1.000±0.0500.580±0.0490.450±0.069B1.000±0.0500.410±0.0250.400±0.014C1.000±0.0500.510±0.0320.410±0.018

表2 各組在不同時期葡萄糖的轉(zhuǎn)移量

組別移植前移植后1個月移植后3個月A0.480±0.0530.320±0.0480.390±0.067B0.300±0.0330.190±0.0590.200±0.028C0.370±0.0400.210±0.0540.310±0.039

表3 不同時期各組的OD值

注：同組不同時間比較，P<0.05

表4 不同時期各組移植物微血管的密度

組別移植后1個月移植后3個月A5.22±0.776.74±0.66B2.31±0.443.15±0.47C4.10±0.565.68±0.69

圖1 移植后1個月各組脂肪移植物 圖2 移植后3個月各組脂肪移植物 圖3 注射前3組脂肪顆粒HE染色(×100)a.A組b.B組c.C組 圖4 注射后1個月各組脂肪移植物HE染色(×100)a.A組b.B組c.C組 圖5 注射后3個月各組脂肪移植物HE染色(×100)a.A組b.B組c.C組 圖6 注射后1個月各組脂肪移植物CD34染色(×100)a.A組b.B組c.C組圖7 注射后3個月各組脂肪移植物CD34染色(×100)a.A組b.B組c.C組

Fig 1 Fat transplants after transplantation at 1 month. Fig 2 Fat grafts after transplantation for 3 months. Fig 3 Fat granules before injection in the different groups (HE×100). a. A group. b. B group. c. C group. Fig 4 Fat transplants after injection at 1 month (HE ×100).a. A group. b. B group. c. C group. Fig 5 Fat transplants after injection at 3 months (HE ×100). a. A group. b. B group. c. C group. Fig 6 Fat transplants after injection at 1 month (CD34 ×200). a. A group. b. B group. c. C group. Fig 7 Fat transplants after injection at 3 months (CD34 ×200). a. A group. b. B group. c. C group.

-196℃及-80℃ 條件下短期內(nèi)12周凍存脂肪顆粒具有可行性，適用于臨床移植需求。移植的脂肪不具有永久性，其吸收率據(jù)報道可達(dá)30%～70%[1-2]，由于其較高且不定的吸收率導(dǎo)致臨床結(jié)果的不確定，注射后往往達(dá)不到預(yù)期效果，解決這種問題的方法主要有兩種，過量注射和重復(fù)注射，而過量注射存在后期填充過度的可能會影響手術(shù)效果，而重復(fù)注射需要重復(fù)獲取脂肪，其操作會增加手術(shù)花費和手術(shù)風(fēng)險，增加了整形醫(yī)師的工作量，同時給患者增加更多痛苦和不適，而且給患者的脂肪抽吸術(shù)術(shù)區(qū)帶來重復(fù)創(chuàng)傷[3-4]，增加了許多并發(fā)癥的可能性[5]。而經(jīng)脂肪抽吸術(shù)獲得的脂肪顆粒在完成重復(fù)注射后，多余的脂肪顆粒往往被丟棄，使得在未來可能用于該患者2、3次脂肪移植的材料被浪費掉，因此，將第1次注射后的多余脂肪通過低溫的方法保存起來以備注射，是避免重復(fù)抽取脂肪的好方法。許多脂肪獲取和制備的技術(shù)被介紹，以獲得更好更實用的脂肪細(xì)胞存活性和可預(yù)測的臨床結(jié)果[6-7]，但關(guān)于脂肪顆粒凍存移植后成活率的臨床和實驗報道所得出的結(jié)論往往不一致。2012年，BW Li通過吸脂術(shù)獲取脂肪保存于生理鹽水后經(jīng)預(yù)冷后凍存在-20℃、-80℃、-196℃,2、7 d后，測定活性。凍存2、4周后注射于裸鼠，3個月后移植物取出后做組織學(xué)檢測，結(jié)果體內(nèi)、體外實驗檢測細(xì)胞活性在3種溫度下無明顯差異。Shoshani和Pu等[8-9]將保存在-80℃的脂肪顆粒注射于裸鼠，結(jié)果表明，脂肪可以通過冷凍保存，且其效果與直接注射新鮮脂肪相近。WL Murillo報道了1例以1260 ml凍存脂肪注射于臀部進(jìn)行豐臀的患者，經(jīng)6～48個月的隨訪，臨床評估和MRI顯示，脂肪成活率達(dá)到80%，并認(rèn)為適宜的凍存脂肪可以補(bǔ)充被重吸收的部分而無須重復(fù)獲取脂肪操作[10]。筆者閱讀文獻(xiàn)及結(jié)合實際認(rèn)為，造成實驗結(jié)果不一致的原因可能與脂肪來源、移植宿主、脂肪顆粒的獲取方式、脂肪顆粒的純化制備方法、凍存及復(fù)蘇的方法、移植前脂肪顆粒中是否加入bFGF、Ang-1 、VEGF等促生長物質(zhì)[11-12]、注射層面及手術(shù)無菌操作有關(guān)，因此，從以上等因素入手對整個操作程序進(jìn)行優(yōu)化，可達(dá)到提高凍存脂肪移植后成活率的目的，從而取得更好的臨床效果。

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Study of survival rate of auto-transplanted rat fat stored in different low temperature conditions

ZHANGGuang-yu,YUDong-mei,LUOSai,HAOLi-jun.

(PlasticandCosmeticCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

HAOLi-jun,Email:lijunhao368@163.com

Objective To explore the survival rate of rat fat stored in -80℃ and -196℃ at 1～3 months after autotransplantation, further detecting the history and activity of transplanted fat. Methods Laboratory animals were grouped, fat particles were harvested and treated, and then the fat particles were taken out and detected at 3 months after cryopreservati; animal models were prepared to harvest fat transplants, and histological activity of fat particles and transplants was detected. Glucose transportation test was also performed. Results The survival ratio of transplants in the A group was greater than that in the C group, which was greater than that in the B group at one month after transplantation (P<0.05);therewasnosignificantdifferenceamongthethreegroupsat3months.SurvivalratiosofAgroupandCgroupat3monthswerefewerthanthatinonemonth,buttheBgroupremainedthesamevolumeoftransplantsatthetwoperiods. Conclusion Under -80℃, -196℃, the volume and activity of the stored fat were well-kept after transplantation. The histology and activity of the fat stored at -196℃ were almost the same as the fresh fat. Therefore, the fat tissues stored in -80℃, -196℃ container can meet the needs of the repeated clinical injection within a short period.

Fat granule; Cryopreservation; Auto transplantation; Survival rate; Graft viability

150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形美容中心 第一作者：張廣宇(1989-)，男，黑龍江雙鴨山人，住院醫(yī)師，碩士. 通信作者：郝立君,150001，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形美容中心,電子信箱：lijunhao368@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.03.020

R-332；R

A

1673-7040(2016)03-0181-05

2015-12-15)