陳潤(rùn)芳， 李攀登， 張遠(yuǎn)貴， 張 莉

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實(shí)驗(yàn)研究

Livin、Smac在嬰幼兒增生期血管瘤中的表達(dá)及其意義

陳潤(rùn)芳， 李攀登， 張遠(yuǎn)貴， 張 莉

目的 研究嬰幼兒增生期血管瘤組織中Livin和Smac的表達(dá)并進(jìn)行相關(guān)性分析，初步探討Livin和Smac在血管瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 采用RT-PCR和免疫組化分別檢測(cè)LivinmRNA、SmacmRNA和蛋白在20例嬰幼兒增生期血管瘤和15例正常皮膚組織中的表達(dá)。結(jié)果 以上2種組織中LivinmRNA、SmacmRNA和蛋白的表達(dá)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。血管瘤中LivinmRNA的表達(dá)水平和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常皮膚組織(P<0.05)，血管瘤中SmacmRNA的表達(dá)水平和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率低于正常皮膚組織(P<0.05)；增生期血管瘤組織中Livin和Smac蛋白的表達(dá)呈負(fù)關(guān)聯(lián)。結(jié)論Livin基因高表達(dá)可能抑制了Smac基因表達(dá)，從而導(dǎo)致了血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的失衡，最終導(dǎo)致了血管瘤的形成。

血管瘤；Livin；Smac； 嬰幼兒； 增生期

嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒期較常見的良性腫瘤，發(fā)病率較高，嚴(yán)重危害著患兒的身心健康。血管瘤有其獨(dú)特的自然病史：增生期和消退期。但其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。大量研究顯示，血管瘤的增生和消退可能是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡失衡所造成的。Livin、Smac是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)蛋白，在惡性腫瘤中研究報(bào)道較多。自2013年8月至2014年12月，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院采用RT-PCR和免疫組化方法，分別檢測(cè)增生期血管瘤組織中LivinmRNA、SmacmRNA和蛋白的表達(dá)水平及其相關(guān)性，探討二者在嬰幼兒血管瘤形成過(guò)程中的作用和意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 由徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科提供標(biāo)本。嬰幼兒增生期血管瘤20例(術(shù)后按 Mulliken 標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)病理證實(shí)為增生期血管瘤)。年齡1～36個(gè)月；男性8例，女性12例。瘤體周圍正常皮膚組織15例。所有標(biāo)本術(shù)前均未進(jìn)行任何治療。患兒家屬對(duì)取材均知情同意。

1.2 主要試劑 兔抗人Livin、Smac多克隆抗體(美國(guó)SANTA CRUZ公司)； SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Trizol Reagent(美國(guó)INVITROGEN 公司)；RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒(立陶宛MBI公司)。

1.3 RT-PCR 切取實(shí)驗(yàn)標(biāo)本100 mg，按說(shuō)明書提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用Primer Premier 5.0并根據(jù)GenBank所提供的LivinmRNA、SmacmRNA序列設(shè)計(jì)引物，上海捷瑞公司合成(表1)。PCR反應(yīng)體系：PCR Mix 25 μl、Forward Primer 1 μl、Reverse Primer 1 μl、cDNA 1 μl、Water,nuclear-free 22 μl。PCR反應(yīng)條件：⑴Livin，94℃預(yù)變性3 min；變性：94℃，30 s；退火：60℃，30 s；延伸：72℃，45 s，共32循環(huán)；延伸：72℃ 7 min。⑵Smac，94℃預(yù)變性3 min，變性：94℃，40 s，退火：58℃，30 s，延伸：72℃,40 s，共32循環(huán)；延伸：72℃,5 min。⑶內(nèi)參基因 β-actin, 94℃預(yù)變性3 min；變性：94℃，30 s；退火：65℃，30 s；延伸：72℃,45 s，共32循環(huán)；延伸：72℃,7 min。取 5 μl PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)成像并進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以目的條帶熒光強(qiáng)度值同與之配對(duì)的內(nèi)參照 β-actin 擴(kuò)增條帶的熒光強(qiáng)度值的比值(即β-actin校正值)表示。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 按照SP染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。分別按1∶100和1∶50稀釋一抗：兔抗人Livin、Smac多克隆抗體。采用陽(yáng)性系數(shù)(染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比)判定染色結(jié)果。采用同一顯微鏡倍數(shù)(×40)觀察并隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)[1]：0分(基本不染色)，1分(染色淡)，2分(染色中等)，3分(染色深)。陽(yáng)性細(xì)胞百分率(表達(dá)陽(yáng)性的病例/總病例數(shù)×100%)標(biāo)準(zhǔn)：0分(<5%)，1分(6%～25%)，2分(26%～50%)，3分(>51%)。陽(yáng)性系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：0～1分為陰性(-)；2～9分為陽(yáng)性，其中弱陽(yáng)性(+)：2～3分，中等陽(yáng)性(++)：4～6分，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：9分。

表1 RT-PCR所用引物及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用兩樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用Kuskal-WallisH檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果 LivinmRNA在嬰幼兒增生期血管瘤組織中高表達(dá)，與正常皮膚中LivinmRNA比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SmacmRNA在嬰幼兒增生期血管瘤組織中低表達(dá)，與正常皮膚中SmacmRNA比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，2及表2。

圖1 2種組織LivinmRNA表達(dá)情況 (M：Marker；1：血管瘤；2：正常皮膚) 圖2 2種組織SmacmRNA表達(dá)情況 (M：Marker；1：正常皮膚；2：血管瘤)

Fig 1 Expression of livin mRNA in 2 tissues (M：Marker. 1: hemangioma. 2: normal skin.). Fig 2 Expression of Smac mRNA in 2 tissues (M: marker. 1: normal skin. 2: hemangioma.).

表2 2種組織中Livin和Smac mRNA的表達(dá)

注：﹡與正常皮膚比較P<0.05

2.2 免疫組化染色結(jié)果Livin在嬰幼兒增生期血管瘤組織中主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核中，表現(xiàn)為棕黃色染色，陽(yáng)性表達(dá)率為80%；正常皮膚組織中少量表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為40%。Smac表達(dá)于正常皮膚上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，亦表現(xiàn)為棕黃染色，陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)93%；在嬰幼兒增生期血管瘤組織中少量表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為25%。見表3，4及圖3。

2.3 嬰幼兒增生期血管瘤組織中Livin和Smac蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 將血管瘤組織中Livin和Smac蛋白表達(dá)進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，r=-0.336，P<0.01，說(shuō)明增生期血管瘤組織中Livin和Smac蛋白的表達(dá)呈負(fù)關(guān)聯(lián)。

3 討論

嬰幼兒血管瘤發(fā)病率較高，男女比例為1∶3～1∶5。嬰幼兒血管瘤是血管內(nèi)皮細(xì)胞克隆性增生所形成的良性腫瘤，伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和快速大量的微血管形成。但血管瘤有其獨(dú)特的自然病史：增生期、消退期和消退完成期。目前尚未完全闡明其確切的發(fā)病機(jī)制。血管瘤肉眼(宏觀)所見的增生和消退可能就是血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(微觀)增生和凋亡的外在表現(xiàn)。而血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制目前仍不完全明確。經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑有2條，分別為細(xì)胞外途徑(細(xì)胞表面死亡受體通路)和細(xì)胞內(nèi)途徑(線粒體通路)。細(xì)胞內(nèi)途徑主要與細(xì)胞色素C、Bcl-2、Bax和Caspase-9等相關(guān)，細(xì)胞外途徑主要涉及Fas/FasL及Caspase-8等。

凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)是在人類進(jìn)化過(guò)程中相當(dāng)保守的一類凋亡抑制蛋白。Livin又名腎臟凋亡蛋白抑制因子或黑色素細(xì)胞瘤凋亡蛋白抑制因子，是最新發(fā)現(xiàn)的IAPs的一名新成員，亦是到目前為止被發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一[2]。Livin擁有BIR和RING鋅指結(jié)構(gòu)域(lAPs家族所特有)，其能通過(guò)多種途徑完成對(duì)細(xì)胞的凋亡抑制作用。楊珊珊等[3]研究顯示，Livin 能通過(guò)其特有的BIR 結(jié)構(gòu)域與凋亡核心蛋

表3 2種組織中Livin的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)

注：﹡與正常皮膚比較P<0.05

表4 2種組織種Smac的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)

注：Kuskal-Wallis H檢驗(yàn)，﹡與正常皮膚比較P<0.05

白Caspase-3結(jié)合，并導(dǎo)致其失活和降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制。肖維等[4]研究發(fā)現(xiàn)，Livin在多數(shù)惡性腫瘤組織中高表達(dá)，而在成人的正常組織中則表現(xiàn)為低表達(dá)或不表達(dá)。本研究表明，LivinmRNA和蛋白在嬰幼兒增殖期血管瘤中陽(yáng)性表達(dá)率高于正常皮膚組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Livin基因在嬰幼兒增殖期血管瘤中的表達(dá)上調(diào)， 我們推測(cè)其可能參與了血管瘤的形成、增殖過(guò)程，在血管瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了重要作用。

Smac第2個(gè)線粒體來(lái)源的胱氨酸酶激活劑，亦是最新被發(fā)現(xiàn)的促凋亡分子之一[5]，也是迄今為止被發(fā)現(xiàn)的惟一能抑制多個(gè)IAPs家族成員活性的蛋白。 人類Smac基因位于第12號(hào)染色體的長(zhǎng)臂是由7個(gè)外顯子組成，其基因全長(zhǎng)1.5kb。Smac是在細(xì)胞的胞質(zhì)中合成,共計(jì)239個(gè)氨基酸組成，其中N-末端55個(gè)氨基酸殘基為線粒體靶序列(mitochondrialtargetingsequence,MTS)以確保Smac移入線粒體。于線粒體內(nèi)MTS被信號(hào)肽剪切，從而使Smac獲得凋亡活性，成熟的Smac分子含有184個(gè)氨基酸。Smac可與Livin的BIR結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合以解除IAP的抑制作用并釋放有活性的Caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6-9]。IAPs除了含有BIR結(jié)構(gòu)域，還具有泛素連接酶活性的指環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)鋅指結(jié)構(gòu)域。有研究[10-11]稱，IAPs中的E3泛素連接酶可以使與 BIR結(jié)合的SMAC泛素化，從而實(shí)現(xiàn)SMAC的降解而完成凋亡抑制作用。X線晶體衍射成像顯示，Smac是通過(guò)N-端的丙氨酸-纈氨酸-脯氨酸-異亮氨酸與IAP家族中的BIR結(jié)構(gòu)域表面凹槽相互結(jié)合，從而解除對(duì)Caspase-3抑制而發(fā)揮促凋亡的生物學(xué)作用。肖維和Verhagen等[4,12]發(fā)現(xiàn)，Smac廣泛表達(dá)于人體正常組織，但在大多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)降低或缺失，而且表達(dá)量也因惡性腫瘤的不同而差異較大，提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Smac可能起著非常重要的作用。但Smac在嬰幼兒增生期血管瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用目前相關(guān)研究報(bào)道甚少。我們研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒增生期血管瘤組織中 SmacmRNA的表達(dá)水平和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率低于正常皮膚組織。因Livin和Smac都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，且在血管瘤中均表達(dá)異常，兩者有無(wú)內(nèi)在的相關(guān)性？為此我們進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)嬰幼兒增生期血管瘤中Livin和 Smac的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。我們推測(cè)兩者在嬰幼兒增生期血管瘤的發(fā)生發(fā)展中存在著相互拮抗或負(fù)反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系。

圖3 2種組織中Livin(A)、Smac(B)蛋白的表達(dá) (×400) (1：血管瘤 2：正常皮膚)

Fig 3 Livin (A), SMAC (B) protein expression in two kinds of tissues (×400) (1: hemangioma. 2: normal skin.)

綜上所述，Livin基因的過(guò)度激活和Smac基因的低表達(dá)，可能在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)通路中起重要的作用。我們推測(cè)Livin基因的高表達(dá)，可能抑制了Smac基因表達(dá)或與Smac結(jié)合抑制了Smac的凋亡作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不足，并導(dǎo)致血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的失衡，使增殖明顯大于凋亡，因而血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)了過(guò)度增殖，最終導(dǎo)致血管瘤的形成，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。Livin、Smac基因可能在嬰幼兒血管瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起了關(guān)鍵性作用。進(jìn)一步深入探討二者與嬰幼兒血管瘤的關(guān)系，可能為嬰幼兒血管瘤發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路，為其臨床防治提供新途徑。

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Research on the expression and significance of Livin and Smac in prolifer-ative infantile hemangioma

CHENRun-fang,LIPan-deng,ZHANGYuan-gui,ZHANGLi.

(DepartmentofClinicalLaboratory,BurnPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221002,China)

LIPan-deng,Email:climbli@qq.com

Objective To investigate the expression of Livin and Smac in proliferative infantile hemangioma and analyze their relationship. Preliminary study of the significance of Livin and Smac in the pathogenesis of hemangiomas. Methods RT-PCR and immunohistochemical methods were used to detect mRNA and protein expression of Livin and Smac in proliferative infantile hemangioma (20 cases) and normal skin tissue (15 cases). Results There are significant differences in the mRNA and protein expression of Livin and Smac in the two kinds of tissue. Compared with the normal skin tissue (P<0.05),themRNAandproteinpositiveexpressionlevelofLivinwashigher(P<0.05),whilethemRNAexpressionlevelandproteinpositiveexpressionrateofSmacwaslower(P<0.05).TherewasnegativeassociationbeweenLivinandSmacproteinexpressioninproliferativeinfantilehemangioma. Conclusion High expression of the Livin gene may inhibit the expression of the Smac gene and lead to the imbalance between proliferation and apoptosis of hemangioma endothelial cells, eventually leading to the formation of hemangiomata.

Hemangioma; Livin; Smac; Infantile; Prolifer-ative

221002 江蘇 徐州，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院(檢驗(yàn)科：陳潤(rùn)芳；燒傷整形外科：李攀登,張遠(yuǎn)貴);蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 整形外科(張 莉) 第一作者：陳潤(rùn)芳(1990-)，女，安徽蚌埠人，檢驗(yàn)醫(yī)師. 通信作者：李攀登,221002,徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 燒傷整形外科，電子信箱:climbli@qq.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.12.013

R

A

1673-7040(2016)12-0744-04

2016-07-08)