何 越,田智泉,郜香黎，李敏鴿，冉永峰，黃馨慧

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實驗研究

人羊膜脫細胞基質填充材料的生物相容性及動物有效性研究

何 越,田智泉,郜香黎，李敏鴿，冉永峰，黃馨慧

目的 探討人羊膜脫細胞基質填充材料的生物相容性及動物有效性。方法 通過生物學評價實驗對羊膜脫細胞基質填充材料的刺激性、致敏性、細胞毒性等進行檢測，并通過大鼠皮內植入實驗檢測材料的動物有效性(以上市產品雙美膠原蛋白作為對照)。結果 羊膜脫細胞基質填充材料無致敏性、無刺激性，且細胞毒性不大于1級；大鼠皮內植入有效性實驗顯示，羊膜脫細胞基質填充材料于植入后20周依然有肉眼可觀察到的材料保留。雙美膠原植入劑降解完全，肉眼和HE染色均未見材料。且兩種材料在體內降解期間的炎癥反應和免疫排斥反應均為輕度反應。結論 人羊膜脫細胞基質填充材料具有良好的生物相容性，無明顯炎癥及免疫排斥反應。其在大鼠皮內耐降解性強，保留時間較長，可作為一種安全有效的填充注射產品應用于臨床。

人羊膜脫細胞基質; 生物相容性; 動物有效性； 填充材料

目前，被美國FDA以醫(yī)療器械批準上市的用于修復皮膚組織缺損的可吸收材料包括:⑴透明質酸鈉；⑵膠原蛋白；⑶羥基磷灰石；⑷聚乳酸[1-2]。羊膜脫細胞基質填充材料屬于可吸收膠原類材料,已有大量研究證實，羊膜本身就是一種良好的生物材料[3]，羊膜臨床應用的研究很多，如眼科、口腔、外科、泌尿科等，且多數臨床效果良好[4-5]。但關于羊膜脫細胞基質填充材料在整形美容、注射填充方面的相關研究少見。自 2012年3月至2015年10月，陜西瑞盛生物科技有限公司研發(fā)部對專利方法所制備的羊膜脫細胞基質填充材料的生物相容性及動物有效性進行了評價，以客觀、準確的反應其安全性。

1 對象與方法

1.1 羊膜脫細胞基質填充材料的制備

1.1.1 對象與設備 新鮮羊膜(陜西省婦幼保健院獲取，并與患者簽訂知情同意書)；胰蛋白酶、碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，均購買自美國GIBCO公司；控溫搖床(上海君翼儀器設備有限公司)；低溫高速粉碎機(德國FRITSCH公司)；高速微射流均質機(美國DEBEE公司)。

1.1.2 制備方法 取新鮮羊膜，使用75%乙醇進行病毒滅活，再使用0.25%胰蛋白酶進行脫細胞處理，配置EDC∶NHS(4∶1)體系進行交聯(lián)改性，之后采用純化水進行震蕩清洗，充分洗去殘留試劑，只保留羊膜細胞外基質成分。干燥后利用低溫粉碎機將羊膜細胞外基質粉碎成粒徑為60～120 μm的微粒，并與PBS溶液配置成混懸液，混懸液進行均質后灌裝于預灌封注射器中，輻照滅菌，即獲得凝膠狀羊膜脫細胞基質填充材料。

1.2 生物相容性檢測

1.2.1 致敏性 取白化豚鼠30只，體質量250～300 g，2～3個月齡，來源于第四軍醫(yī)大學動物中心。隨機分成3組，陽性對照組(10只)，試驗組(10只)、陰性對照組(10只)，開始適應環(huán)境，為時1周。試驗前1 d，在胸廓的背前區(qū)備皮4 cm×6 cm。于豚鼠背部去毛，消毒后于肩胛骨內側從頭向尾成對注射6個點，每點注射 0.1 ml,見圖1。A點注射完全弗氏佐劑與生理鹽水(1∶1)混合液；B點試驗組注射待檢物與完全弗氏佐劑的等體積混合物，陰性對照組則注射生理鹽水，陽性對照組注射巰基苯并噻唑；C點注射前2種注射液的等體積混合物。之后進行局部誘導和激發(fā)，并分別于激發(fā)后24 h和48 h觀察各組動物激發(fā)部位皮膚情況，在自然光或全光譜光線下觀察皮膚反應。根據Magnusson和Kligman分級標準對皮膚反應情況進行分級：0級，無明顯改變；1級，散發(fā)性或斑點狀紅斑；2級，中度融合性紅斑；3級，重度紅斑和水腫[6]。

1.2.2 刺激性 取12只新西蘭兔，體質量(2.0±0.2) kg，3～4個月齡，來源于第四軍醫(yī)大學動物中心。分籠飼養(yǎng)于空調室內，室溫(21±2)℃，相對濕度40%～70%，光照12 h/d，自由飲用自來水。試驗前適應性飼養(yǎng)3 d。并在試驗前24 h將動物背部脊柱兩側背毛去除10 cm×15 cm，分為樣品組和陽性對照組。通過單次接觸、多次給藥,在同一部位行皮膚刺激性試驗，確保每次給藥時間相同，貼敷時間一般不超過4周。在自然光線下觀察皮膚反應(紅斑和水腫)，根據皮膚反應情況打分。紅斑和焦痂形成：無紅斑，0分；輕微紅斑(勉強可見)，1分；明顯紅斑，2分；中度～重度紅斑，3分；嚴重紅斑(紫紅色)至輕微焦痂形成，4分。水腫形成：無水腫，0分；輕微水腫(勉強可見)，1分；輕度水腫(皮膚隆起輪廓清楚)，2分；中度水腫(皮膚隆起約1 mm)，3分；重度水腫(皮膚隆起超過1 mm，范圍擴大)，4分。兩項評分之和為其總分。根據GB16886[6]第十部分對刺激的評價標準評價產品有無刺激性。

1.2.3 細胞毒性 將傳代48～72 h生長旺盛的L929細胞胰酶消化收集，用高糖DMEM培養(yǎng)基配置成1×104/ml的細胞懸液，接種至96孔板中，每孔200 μl。樣品按照1∶9比例浸提，浸提介質為含10%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，浸提溫度為37℃，浸提時間為24 h。將試驗組、空白對照組及陽性對照組分別加入細胞懸液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。在培養(yǎng)第5天時，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長下測各孔吸光度值(OD值)，用空白調零孔OD值調零，取平均值并記錄。根據各組的吸光度均值計算細胞的相對增殖率。根據細胞毒性反應分級標準對反應分級：細胞相對增殖率≥100%為0級，80%～99%為1級，50%～79%為2級，30%～49%為3級，1%～29%為4級，0為5級。

1.3 動物有效性實驗檢測

大鼠6只，220 g左右，3～4個月齡。分籠飼養(yǎng)于空調室內，室溫(21±2)℃，相對濕度40%～70%，光照12 h/d，自由飲食飲水。每只大鼠背部皮下分別植入羊膜脫細胞基質填充材料和雙美加強型膠原蛋白植入劑(臺灣雙美生物科技有限公司)各1個點，每點注射0.1 ml樣品。分別于術后1、4、8、12、16和20周各處死1只大鼠并取材，拍照記錄手術部位外觀，觀察有無紅腫、潰爛等不良反應發(fā)生，對比觀察不同植入材料的皮下降解情況，并對取材點進行常規(guī)HE組織學檢測及免疫組化檢測。

2 結果

2.1 生物相容性

2.1.1 致敏性 所有豚鼠皮內誘導體積均為0.1 ml,激發(fā)體積均為0.1 ml。根據Magnusson和Kligman分級標準，激發(fā)后24 h和48 h，試驗組和陰性對照組的反應等級均為0級，陽性對照組為2、3級，有中、重度的致敏反應。

2.1.2 皮膚刺激性 樣品組在24 h時，1例出現輕微紅斑；48 h時，1例出現輕微紅斑，1例出現輕微水腫。陽性對照組無一例出現紅斑和水腫。根據GB16886標準，樣品組與陽性對照組的評分差值小于1.0，且平均評分積分小于0.5，判斷本產品無刺激性。

2.1.3 細胞毒性 羊膜脫細胞基質填充材料的細胞增殖率為(92.00±1.29)%，細胞毒性為1級。

2.2 動物有效性

2.2.1 大體觀察與HE染色 大鼠背部注射羊膜脫細胞基質填充材料4周時，材料保留明顯，材料周圍有少量炎癥細胞浸潤；4周后炎癥明顯降低，材料緩慢降解；20周時依然可見部分材料殘留，基本無炎癥反應發(fā)生(圖2)。雙美膠原蛋白在20周時材料基本降解完全，僅見少許材料降解痕跡(圖3)。

2.2.2 免疫組化 免疫組化檢測結果顯示，與陰性對照組相比，試驗組在注射后4周和20周均無明顯的免疫反應(圖4)。

3 討論

3.1 生物相容性 羊膜位于胎盤的最內層，其光滑，無血管、神經及淋巴，無免疫原性。華萍等[7]發(fā)現，凍干羊膜或新鮮羊膜均具有良好的組織相容性,不會引起明顯的急性免疫排斥反應,作為異體移植材料免疫安全性較好。

圖1 豚鼠背部注射示意(1為大鼠頭部，2為注射點，3為尾部) 圖2 大鼠背部注入羊膜脫細胞基質填充材料 a.術后4周大體 b.術后4周HE染色(×40) c.術后20周大體 d.術后20周HE染色(×40) 圖3 大鼠背部注入雙美加強型膠原蛋白植入劑 a.術后4周大體 b.術后4周HE染色(×40) c.術后20周大體 d.術后20周HE染色(×40) 圖4 材料植入部位不同時間點的免疫反應情況(×100) a.術后4周 b.術后20周
Fig 1 Schematic diagram of guinea pig back injection (1 is the head of rats,2 is injection site and 3 is rat tail). Fig 2 Gross observation and HE staining for amniotic membrane matrix implants at the rat back. a.postview at 4 weeks by gross observation. b.postview at 4 weeks by HE staining (×40). c.postview at 20 weeks by gross observation. d.postview at 20 weeks by HE staining (×40). Fig 3 Gross observation and HE staining for Sunmax plus at the rat back. a.postview at 4 weeks by gross observation. b.postview at 4 weeks by HE staining (×40). c.postview at 20 weeks by gross observation. d.postview at 20 weeks by HE staining (×40). Fig 4 Immune response of embedded parts at different time points(×100). a.postview at 4 weeks. b.postview at 20 weeks.

筆者報道的羊膜基質是以人體羊膜為原料，脫去細胞后保留以基底膜為主的細胞外基質，去除了其他抗原成分，主要成分為膠原蛋白及其他結構蛋白。羊膜脫細胞基質填充材料是將脫細胞處理的羊膜基質通過物理機械方法粉碎成粒徑較為均一的微粒，之后均勻分散于低滲緩沖液中制成羊膜基質混懸液，填充于預灌封注射器中。本產品使用專利技術對羊膜基質進行脫細胞、去抗原、滅活病毒及滅菌處理等，保證了在去除細胞成分的同時，充分保留細胞外基質的空間結構以及主要成分，有效保證植入的安全性。研究結果也顯示，所制備的產品具有良好的生物相容性，不引起明顯的過敏反應和免疫排斥反應。這也與Spira等[8]的報道結果相一致，其經過動物實驗證實，人羊膜膠原植入12個月，在纖維素增生、血管浸潤和脂肪細胞與植入物的接合過程，其炎癥反應均很低。

3.2 動物有效性

目前，國內外批準的注射填充類產品中，市場較為常見的是透明質酸和膠原類。雙美膠原蛋白植入劑屬于膠原類產品，其是由提取的豬皮膠原交聯(lián)后與生理緩沖液混合形成，有報道稱，雙美膠原產品的體內有效性為9～12個月，且炎癥反應小，無明顯免疫反應[9]。

筆者報道的羊膜脫細胞基質填充材料，有效成分為脫細胞羊膜基質，為同種異體原料，主要成分為膠原蛋白。膠原是細胞外最重要的不溶性纖維蛋白，是構成細胞外基質的骨架成分，可以提高細胞的張力和彈性，并且具有低免疫原性的特點[10-11]。為進一步延遲體內降解時間，產品進行了EDC交聯(lián)處理，并通過有效清洗進行清除，經檢測合格，且對終產品進行了輻射照射滅菌。

通過動物有效性實驗對比證實，羊膜脫細胞基質填充材料在觀察期，除注射后1周炎癥相對明顯外，其他各觀察點均具有較低的炎癥反應，且于注射后4、12和20周時行免疫組化檢測，均無明顯反應。在20周時，雙美膠原蛋白已經完全降解，而羊膜脫細胞基質填充材料降解緩慢，依然有較為明顯的殘留(22周時完全降解)。因此，羊膜脫細胞基質填充材料符合目前較為理想的保留時間較長的可降解吸收型填充產品的要求。本產品為可注射細胞外基質產品，相比于高純度的膠原產品，所含的細胞外基質具有天然的生物支架結構，植入人體后能很好地引導周圍組織纖維細胞長入，間接提高膠原分泌，而且其基質成分的微粒大小不同，使其能被更好的控制、延遲體內降解時間，提高有效性。故羊膜脫細胞基質填充材料具有更好的填充效果。Sclafani等[12]也證實，微?；募毎饣|產品與提取膠原類植入填充產品相比，其在鼻唇溝或唇部填充方面具有更好的填充效果和更長的持續(xù)時間，且植入皮內較植入皮下維持效果更為顯著。

綜上所述，人羊膜脫細胞基質填充材料具有良好的生物相容性，無明顯炎癥及免疫排斥反應；通過動物實驗證實其皮內耐降解性強，保留時間長，可作為一種安全、有效的美容填充注射產品使用。

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Research of biocompatibility and effectiveness in animals of human amniotic membrane acellular matrix filler material

HEYue,TIANZhi-quan,GAOXiang-li,LIMin-ge,RANYong-feng,HUANGXin-hui.

(DepartmentofResearchandDevelopment,ShanxiReshineBiotechnologyco.,LTD,Xi′an710077,China)

HUANGXin-hui,Email:huangxinhui@cbmrt.cn

Objective To investigate the biocompatibility and effectiveness in animals of human amniotic membrane acellular matrix filler material.Methods Irritation,sensitivity,and cell toxicity were detected by biological assessment experiments,and the efficacy of the material in animals was also inspected by a rat subcutaneous implantation experiment (Control group for Sunmax Ⅱ collagen implant agent).Results Amniotic membrane acellular matrix filler material was not sensitive or irritative,and the cytotoxicity of the cells was less than 1 degree.The results of the rat implant experiment showed the amniotic membrane matrix implants still retained visiblity at 20 weeks,while the Sunmax Ⅱ collagen implant agent degraded completely to detection by the naked eye and HE staining.The inflammatory reaction and immune rejection reaction of the two materials in vivo were both mild.Conclusion Human amniotic membrane acellular matrix material has excellent biocompatibility without obvious inflammation and immune rejection.The acellular amniotic matrix can be used as a safe and effective filling injection in clinical application because of its strong resistance to degradation and longer retention time.

Human amniotic acellular matrix; Biocompatibility; Animal efficacy; Filler material

710077 陜西 西安，陜西瑞盛生物科技有限公司 研發(fā)部

何 越(1987-)，男，陜西西安人，碩士.

黃馨慧，710077，陜西瑞盛生物科技有限公司 研發(fā)部，電子信箱：huangxinhui@cbmrt.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.019

R318;R-332

A

1673-7040(2016)06-0381-04

2016-02-07)