李 偉,畢 莉,李桂秋,尹曉東

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實驗研究

聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌生物膜作用的體外研究

李 偉,畢 莉,李桂秋,尹曉東

目的 觀察連花清瘟膠囊水溶解物與頭孢替唑鈉聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌生物膜的體外破壞作用。方法 藥物分為頭孢替唑鈉組、連花清瘟組、聯(lián)合用藥組和空白對照組；微量肉湯稀釋法分別測定連花清瘟膠囊水溶解物和頭孢替唑鈉對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度；用酶標儀檢測金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)變化；用掃描電鏡觀察金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)細菌受藥物作用后的形態(tài)和大小。結(jié)果 連花清瘟組活菌數(shù)較空白對照組低(P<0.05)；頭孢替唑鈉組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合用藥組活菌數(shù)低于單獨用藥組(P<0.05)。掃描電鏡顯示頭孢替唑鈉組生物膜中，大量細菌密集在一起,但密度較空白對照組稀疏，細菌形態(tài)基本正常，大小基本一致；連花清瘟組生物膜中形態(tài)不規(guī)則，大小不一致；而聯(lián)合用藥組形態(tài)更加不規(guī)則，大小更加不一致。結(jié)論 連花清瘟膠囊水溶解物對金黃色葡萄球菌生物膜具有顯著破壞作用，與頭孢替唑鈉聯(lián)合應(yīng)用可起到協(xié)同增效的作用。

連花清瘟膠囊水溶解物； 頭孢替唑鈉； 金黃色葡萄球菌； 生物膜; 聯(lián)合用藥; 協(xié)同增效； 最小抑菌濃度

金黃色葡萄球菌是臨床難治性感染的主要致病菌之一。對其治療效果欠佳，其中重要的原因是金黃色葡萄球菌形成了細菌生物膜[1]，導(dǎo)致大多數(shù)抗生素無法突破細菌形成的生物膜而耐藥。已有報道顯示,連花清瘟膠囊可以突破細菌生物膜[2]，而連花清瘟膠囊和頭孢替唑鈉聯(lián)合用藥對于金黃色葡萄球菌生物膜是否具有協(xié)同增效作用的研究尚屬空白。自2014年10月至2015年5月，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外二科觀察了連花清瘟與頭孢替唑鈉聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌的體外破壞作用，以期為聯(lián)合用藥治療金黃色葡萄球菌感染提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923(來源于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科)。

1.2 藥品與試劑

連花清瘟膠囊(河北以嶺藥業(yè)有限公司)；頭孢替唑鈉注射液(哈藥集團制藥總廠)。連花清瘟膠囊水溶解物：將連花清瘟膠囊內(nèi)粉劑溶于蒸餾水，離心去除未能溶解的藥物，將蒸餾水風(fēng)干便得到連花清瘟膠囊水溶解物。

1.3 主要儀器

酶標儀(美國美谷分子公司),掃描電子顯微鏡(日立公司)。

1.4 方法

1.4.1 測定最小抑菌濃度 通過微量肉湯稀釋法分別測定連花清瘟膠囊水溶解物與頭孢替唑鈉對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度[3]。

1.4.2 實驗分組 將各藥物溶解于含0.5%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基，使配成的各藥液濃度均為最小抑菌濃度，分為4組：頭孢替唑鈉組、連花清瘟組、聯(lián)合用藥組和空白對照組?？瞻讓φ战M為含0.5%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基，不含藥物。

1.4.3 建立金黃色葡萄球菌生物膜模型 用含0.5%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基調(diào)整金黃色葡萄球菌菌液吸光度A600為0.05，接種于96孔板，200 μl/孔；接種于24孔板，500 μl/孔，37℃培養(yǎng)24 h，形成生物膜。其中24孔板底部放有經(jīng)滅菌的15 mm×15 mm玻片爬片[4]。

1.4.4 酶標儀檢測金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)變化 吸取96孔細胞培養(yǎng)板中的菌液，按實驗分組加入藥液200 μL,空白對照組加入等量培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，PBS小心沖洗,去除各組藥液和空白對照組的培養(yǎng)基。各組加入5 g/L MTT，20 μl/孔避光孵育4 h后吸除未與生物膜結(jié)合的MTT；加入150 μl DMSO溶液，搖床震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。利用酶標儀檢測A490吸光值；重復(fù)3次實驗,取平均值[5]。

1.4.5 掃描電鏡觀察金黃色葡萄球菌生物膜 吸取24孔板中成熟金黃色葡萄球菌生物膜上清，洗去懸浮細菌，按實驗分組加入藥液，空白對照組內(nèi)加入培養(yǎng)基，體積均為500 μl。37℃培養(yǎng)24 h，樣本用PBS溶液清洗2次，洗掉懸浮細菌，2.5%戊二醛固定，乙醇逐級脫水，真空冷凍干燥，噴金，利用掃描電子顯微鏡拍照，觀察金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)細菌受藥物作用后的形態(tài)和大小。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 最小抑菌濃度

頭孢替唑鈉和連花清瘟膠囊水溶解物對金黃色葡萄球菌ATCC25923的最小抑菌濃度分別為0.12 μg/ml和5 mg/ml。

2.2 金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)

酶標儀檢測的各組A490吸光值分別為3.267±0.030(頭孢替唑鈉組)、2.953±0.025(連花清瘟組)、2.318±0.103(聯(lián)合用藥組)和3.300±0(空白對照組)；頭孢替唑鈉組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，連花清瘟組較空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組較各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果

空白對照組大量細菌密集疊加在一起，形態(tài)正常，大小基本一致；頭孢替唑鈉組大量細菌密集疊加在一起，密度較空白對照組稍稀疏，形態(tài)基本正常，大小基本一致；連花清瘟組可見菌落散在，形態(tài)不規(guī)則，大小不一致；聯(lián)合用藥組較連花清瘟組的菌落更散在，密度更加稀疏，大小更加不一致。見圖1。

圖1 各組掃描電鏡圖片(×6500) a.空白對照組 b.連花清瘟組 c.頭孢替唑鈉組 d.聯(lián)合用藥組
Fig 1 Pictures of each group (SEM×6500). a.control group. b.water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule group. c.Ceftezole Sodium group. d.drug combination group.

3 討論

因不當?shù)拿廊葑⑸鋵?dǎo)致的感染是一個棘手問題，盡管臨床上積極采用切開引流、換藥及使用抗生素等措施，但有時長期感染仍難以愈合。膿汁細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌是主要致病菌之一，長期感染治療效果不佳的主要原因是細菌耐藥，金黃色葡萄球菌形成生物膜、產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶以及抗生素作用靶點的改變，是其產(chǎn)生耐藥的原因[6]。有報道中成藥連花清瘟膠囊可突破細菌生物膜，故先用中藥破壞生物膜，然后利用抗生素進入細菌殺菌，為臨床尋求新的治療方法提供了一定的基礎(chǔ)[7]。

連花清瘟膠囊由連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、石膏、薄荷腦、紅景天、甘草組成，具有清瘟解毒，宣肺泄熱的作用[8-11]。本研究表明，連花清瘟膠囊水溶解物和頭孢替唑鈉的聯(lián)合應(yīng)用較單一應(yīng)用抑菌作用更強(P<0.05)，聯(lián)合用藥組細菌密度較空白對照組明顯稀疏且大小更加不一，提示連花清瘟膠囊水溶解物和頭孢替唑鈉合用能起到協(xié)同增效作用。其抑菌機制可能是,連花清瘟膠囊水溶解物破壞細菌生物膜后，頭孢替唑鈉可以對生物膜破壞后的細菌起殺滅作用[12]。此結(jié)果為臨床上是否可以制作連花清瘟膠囊水溶解物，對此類感染創(chuàng)口進行局部沖洗和靜脈注射抗生素聯(lián)合用藥，以加速感染創(chuàng)口的愈合，提供了一定的研究基礎(chǔ)。

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Effect of drug combination on the biofilm of Staphylococcus aureus in vitro

LIWei,BILi,LIGui-qiu,YINXiao-dong.

(TheSecondDepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolofStomatologyAffliatedtoHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

YINXiao-dong,Email:yinxiaodong117@126.com

Objective To observe the destructive effect in vitro of water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule combined with Ceftezole Sodium on Staphylococcus aureus biofilm.Methods The drugs were divided into Ceftezole Sodium group,water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule group,drug combination group and control group.The minimal inhibitory concentration of water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule and Ceftezole Sodium against Staphylococcus aureus was detected by a broth microdilution methed.Staphylococcus aureus biofilm was built and a microplate reader was used to evaluate changes in the number of living bacteria.Scanning electron microscopy (SEM) was used to observe the morphology and thickness of bacteria in Staphylococcus aureus biofilm.Results The number of living bacteria in water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule group was decreased compared with the control group (P<0.05),while it was not significant in Ceftezole Sodium group (P>0.05).The number of living bacteria in the drug combination group was decreased compared with either drug alone group (P<0.05).The results of SEM showed Staphylococcus aureus biofilm in Ceftezole Sodium group with a large number of bacteria close together,but the density was a little thin compared with the control group,an almost normal bacterial form,and basically the same size.Staphylococcus aureus biofilm in water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule group showed bacteria was irregular form,different size.Staphylococcus aureus biofilm in drug combination group showed bacteria was more inconsistent form,the more inconsistent size.Conclusion Water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule has a significant destructive effect on Staphylococcus aureus biofilm in vitro.There was a synergetic destructive effect on Staphylococcus aureus biofilm in combination with Ceftezole Sodium.

Water soluble substance of Lianhua Qingwen capsule; Ceftezole Sodium; Staphylococcus aureus; Biofilm; Drug combination; Synergetic destructive effect; Minimal inhibitory concentration

黑龍江省中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合重點科研項目(060032)

150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院 口腔頜面外科二病房(李 偉,尹曉東)；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗科(畢 莉,李桂秋)

李 偉(1989-)，男，河南人，醫(yī)師，碩士研究生.

尹曉東，150001，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院 口腔頜面外科二病房，電子信箱：yinxiaodong117@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.015

R378.1+1

A

1673-7040(2016)06-0368-03

2016-01-25)