吳紅巾，周炳榮，張煒明，張家安，謝淑芬，馬立文，張婷，劉娟，王申，栗丹，易飛，陶艷玲，苗穎穎，張麗超，駱丹（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京　210029）

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點(diǎn)陣激光輔助自體成纖維細(xì)胞經(jīng)皮遞送的初步研究

吳紅巾，周炳榮，張煒明，張家安，謝淑芬，馬立文，張婷，劉娟，王申，栗丹，易飛，陶艷玲，苗穎穎，張麗超，駱丹
（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210029）

摘要：目的觀察點(diǎn)陣激光輔助自體成纖維細(xì)胞經(jīng)皮遞送對(duì)真皮的長(zhǎng)期作用。方法選用健康滿月家豬，取耳緣皮膚分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，傳至三代后收集。取幼豬胸背部皮膚，隨機(jī)分成空白對(duì)照組，點(diǎn)陣激光組，點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組，點(diǎn)陣激光聯(lián)合磷酸鹽緩沖液（PBS）組。3個(gè)月后取已處理皮膚活檢病理檢查，以蘇木精和伊紅（HE）染色、Masson染色法檢測(cè)各組膠原纖維分布情況，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)各組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)情況。結(jié)果HE染色、Masson染色法顯示點(diǎn)陣激光組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組膠原纖維含量較空白對(duì)照組增多，排列更緊密；點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組膠原纖維含量增多最高；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組與點(diǎn)陣激光組、空白對(duì)照組比較，其Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)最高。結(jié)論點(diǎn)陣激光輔助自體成纖維細(xì)胞經(jīng)皮遞送后產(chǎn)生持續(xù)刺激真皮膠原增生作用。

關(guān)鍵詞：點(diǎn)陣激光；自體成纖維細(xì)胞；經(jīng)皮遞送；Ⅰ型膠原；Ⅲ型膠原

點(diǎn)陣激光近年廣泛應(yīng)用于皮膚科，其促進(jìn)藥物滲透吸收作用經(jīng)大量研究報(bào)道，并應(yīng)用于臨床治療中［1］。有研究證實(shí)點(diǎn)陣激光輔助細(xì)胞經(jīng)皮遞送［2］，但研究只觀察短期細(xì)胞存活狀況，進(jìn)入皮膚后其功能表現(xiàn)仍需進(jìn)一步觀察。組織填充術(shù)［3］已大量應(yīng)用于臨床治療，如改善皺紋、填充萎縮性瘢痕和局部凹陷等。填充劑種類多樣，如自體脂肪移植、自體膠原蛋白、硅制劑、透明質(zhì)酸等。自體成纖維細(xì)胞填充技術(shù)能夠刺激產(chǎn)生內(nèi)源性人體膠原，可避免排斥反應(yīng)，Weiss等［4］將2 mL自體成纖維細(xì)胞懸液［（1～2）×107/mL］注射至受試者臉頰，共3次，每次間隔14 d，結(jié)果表明自體成纖維細(xì)胞填充治療是安全有效的。組織填充治療前常需聯(lián)合皮膚磨削術(shù)。點(diǎn)陣激光的工作原理既可以剝脫表皮，同時(shí)熱刺激膠原，產(chǎn)生持久的膠原增生作用［5］。本實(shí)驗(yàn)設(shè)想觀察點(diǎn)陣激光聯(lián)合自體成纖維細(xì)胞是否可以達(dá)到更好的療效，因而進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1器材與試劑盒點(diǎn)陣激光使用微雕點(diǎn)陣王（美國(guó)科醫(yī)人公司）；胰酶購于美國(guó)Amresco公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國(guó)Gibco公司，小牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，Masson染色試劑盒產(chǎn)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒產(chǎn)自日本Toyobo公司，引物由南京金斯瑞科技有限公司合成。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康滿月家豬，雌性1只，購自南京清龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1點(diǎn)陣激光參數(shù)設(shè)定MultiModeTMDeep Fractional深層點(diǎn)陣模式20 mJ，點(diǎn)密度10%。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理豬術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，稱取體質(zhì)量，將豬俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，采用氯胺酮4 mg/kg肌注，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg靜脈注射聯(lián)合麻醉。在幼豬背部皮膚以紋身的形式做好標(biāo)記，并予碘伏消毒3遍，生理氯化鈉溶液擦拭1遍，隨機(jī)分4組：空白對(duì)照組、點(diǎn)陣激光組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組，每組包括5例樣本，每處皮膚面積取2cm×2cm，各組間間隔超過5cm。

1.2.3細(xì)胞分離、培養(yǎng)與傳代：選取幼豬耳緣皮膚，修剪去除皮下、軟骨組織，剪成0.5 cm×0.5 cm皮塊，聚維酮碘浸泡，生理氯化鈉溶液沖洗3次，加入0.5%分散酶，4℃消化18～20 h后分離表、真皮。真皮部分以消化液37℃消化5 min后，加入DMEM培養(yǎng)基，吹打、過濾，過濾后將細(xì)胞液離心，棄上清，加入含15%胎牛血清、0.99 U/mL青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，混勻并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中接種密度為1.0×106個(gè)/皿，取3～4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最后予1mL PBS緩沖液（氯化鈉80 g、氯化鉀2 g、磷酸氫二鈉28.84 g、磷酸二氫鉀2 g、蒸餾水10 000 mL調(diào)至PH 7.0～7.4）收集細(xì)胞數(shù)20×106聯(lián)合點(diǎn)陣激光處理皮膚。

1.2.3HE染色法組織切片脫臘至水，染色，脫水、透明、封片。

1.2.4Masson染色法切片常規(guī)脫蠟，蘇木素染色5～10 min，鹽酸酒精分化，流水藍(lán)化，蒸餾水洗，麗春紅酸性品紅液中染5 min，蒸餾水洗，1%磷鉬酸中染1～3 min，入苯胺藍(lán)液5 min，置60℃溫箱中烘干，二甲苯透明，封固，鏡下觀察。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法取約30～50 mg組織樣本于冰冷的組織勻漿器中，加入1mL預(yù)冷的TRIzol，冰上研磨至無顆粒透明狀溶液，提取總RNA，純化后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后按20 μL反應(yīng)體系擴(kuò)增，引物序列由Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，根據(jù)循環(huán)值（2-ΔΔCT）計(jì)算Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1?、裥湍z原和Ⅲ型膠原以及內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列

2　結(jié)果

2.1不同處理組HE染色及Masson染色比較與空白對(duì)照組相比較，點(diǎn)陣激光組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組以及點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組皮膚膠原纖維均增多、排列更緊密。點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組比單純點(diǎn)陣激光組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組膠原纖維增多更明顯，膠原排列更致密規(guī)則。見圖1。

2.2不同處理組幼豬皮膚Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原基因表達(dá)水平比較點(diǎn)陣激光組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組及點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組與空白對(duì)照組比較，Ⅰ型膠原基因Ⅲ型膠原基因表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。點(diǎn)陣激光組與點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組與點(diǎn)陣激光組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組比較，Ⅰ型膠原基因表達(dá)含量高于2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。點(diǎn)陣激光組、點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組及點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組與空白對(duì)照組比較，Ⅲ型膠原基因表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖1　各組HE染色和Masson染色。

表2　各組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原基因表達(dá)水平比較?。ā纒，n=5）

表2　各組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原基因表達(dá)水平比較　（±s，n=5）

注：a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與點(diǎn)陣激光組比較，P＜0.05；c：與點(diǎn)陣激光+PBS比較，P＜0.05。

組別　Ⅰ型膠原?、笮湍z原空白對(duì)照組　0.6178±0.0238　0.6496±0.0511點(diǎn)陣激光組　0.8156±0.0687a　0.7573±0，0185a點(diǎn)陣激光聯(lián)合PBS組　0.7709±0.0879a　0.7124±0.0142a點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組　1.0016±0.0694abc　1.0037±1.1032abc

3　討論

真皮膠原纖維由Ⅰ型和Ⅲ型膠原構(gòu)成，一般Ⅰ型膠原約占膠原總量的85%～90%，Ⅲ型膠原約占10%～15%。膠原纖維是皮膚張力和充盈的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)在人體老化進(jìn)程中，無論是內(nèi)在的自然老化還是外部環(huán)境造成的光老化，都可見Ⅰ型、Ⅲ型膠原數(shù)量上的減少和質(zhì)量上的降低，最終造成皮膚粗糙、皺紋、毛細(xì)血管擴(kuò)張和不規(guī)則色素沉著等表現(xiàn)［6］。一些炎癥反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致膠原纖維的斷裂、抑制膠原蛋白生成，皮膚真皮膠原纖維減少，遺留萎縮性瘢痕。組織填充術(shù)常用來解決此類問題，但臨床中仍常見一些注射過程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)［7］，如注射層次不易掌握，局部注射不均勻，低于或大于需要量導(dǎo)致填充不全或適得其反；還有可能注射進(jìn)去的細(xì)胞大部分壞死凋亡，可能誘發(fā)炎癥，局部出現(xiàn)紅腫水皰反應(yīng)；還包括注射疼痛感較明顯、甚至注射入血管造成嚴(yán)重反應(yīng)等。

點(diǎn)陣激光的局灶光熱作用原理啟動(dòng)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制，可以直接降解真皮中損傷的膠原，同時(shí)其光熱作用刺激真皮成纖維細(xì)胞活化，刺激新生膠原蛋白的產(chǎn)生，促進(jìn)膠原的不斷合成、分泌和更新以及重塑膠原纖維排列［8］，而不斷改善和修復(fù)真皮組織的結(jié)合和強(qiáng)度。未受破壞的瘢痕以外正常皮膚組織同時(shí)幫助修復(fù)瘢痕組織，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。Naouri等［9］研究發(fā)現(xiàn)一次點(diǎn)陣CO2激光術(shù)后使用皮膚超聲進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)真皮的厚度增加25%，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較，點(diǎn)陣激光組與點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組處理皮膚3個(gè)月后，HE染色及Masson染色可見真皮膠原增多，排列更緊密。Orringer等［10］研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達(dá)與術(shù)前相比，在點(diǎn)陣激光術(shù)后21 d及術(shù)后至少6個(gè)月分別高達(dá)7.5和8.9倍，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，點(diǎn)陣激光組與點(diǎn)陣激光聯(lián)合細(xì)胞組處理皮膚3個(gè)月后，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原基因表達(dá)水平均增加。周炳榮等［11］研究發(fā)現(xiàn)外用脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以改善點(diǎn)陣激光術(shù)后不良反應(yīng)，同時(shí)可以促進(jìn)皮膚修復(fù)。Georgette等［2］研究發(fā)現(xiàn)點(diǎn)陣激光處理后外敷脂肪干細(xì)胞4 h后，即可在激光通道處發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞，48 h可在真皮淺層發(fā)現(xiàn)大量標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)陣激光聯(lián)合自體成纖維細(xì)胞組刺激真皮膠原纖維增生程度高于單獨(dú)點(diǎn)陣激光組，同時(shí)其Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原基因表達(dá)水平高于單獨(dú)點(diǎn)陣激光組。點(diǎn)陣激光處理后產(chǎn)生均勻點(diǎn)陣狀通道，促進(jìn)自體成纖維細(xì)胞均勻滲入皮膚；通過調(diào)整激光能量參數(shù)，設(shè)定激光穿透深度，從而控制細(xì)胞進(jìn)入皮膚水平；同時(shí)點(diǎn)陣激光的光熱作用聯(lián)合自體成纖維細(xì)胞長(zhǎng)久刺激真皮膠原增生。因此本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有助于了解點(diǎn)陣激光更多的臨床應(yīng)用范圍。

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Transdermal Delivery of Autologous Fibroblast by Fractional Ablative Laser

WU Hongjin，ZHOU Bingrong，ZHANG Weiming，ZHANG Jiaan，XIE Shufen，Ma Liwen，ZHANG Ting，LIU Juan，WANG Shen，Li Dan，YI Fei，TAO Yanling，MIAO Yingying，ZHANG Lichao，LUO Dan

First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

Abstract:ObjectiveTo study the effect on dermis with combined treatment of fractional ablative laser and autologous fibroblast.MethodsOne healthy domestic piglet was selected to establish animal model.Ear skin was isolated and cultured fibroblasts.After the third generation the cells was collected.The abdomens of the piglet randomly divided into four groups：control group，fractional ablative laser group，fractional ablative laser with phosphate buffer solution（PBS）group and combination treatment of fractional ablative laser and autologous fibroblast group.Three months later，a biopsy was performed. By hematoxylin-eosin（HE）staining，Masson staining and real-time quantitative polymerase chain reaction，we analyzed collagen fiber arrangement and the mRNA and protein levels of type I collagen，type III collagen.ResultsAccording to HE staining and Masson staining，the amount of collagen in the fractional laser group，fractional laser with PBS group and fractional laser with autologous fibroblast group were much more than in the control group，and arranged more closely；fractional laser with autologous fibroblast group increased highest；real-time quantitative polymerase chain reaction showed the same results，the collagen expression levels of typeⅠandⅢcollagen in the fractional laser with autologous fibroblast group were highest. ConclusionTransdermal delivery of autologous fibroblast using a fractional ablative laser can stimulate and increase the synthesis of collagen.

Key words:Fractional ablative laser；Autologous fibroblasts；Transdermal delivery；TypeⅠcollagen；TypeⅢcollagen

中圖分類號(hào)：R758.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-0709（2016）01-0006-04

通信作者：周炳榮，E-mail：bingrong.2002@163.com；駱丹，E-mail：daniluo2005@163.com

收稿日期：（2015-07-30）