何姍，王朝臣，王樹卿

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402）

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吸附法發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖固定細(xì)胞的條件研究

何姍，王朝臣，王樹卿

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402）

摘要：經(jīng)優(yōu)化篩選，選擇聚氨酯泡沫（HP）為載體，在pH值為7.0，溫度36℃，轉(zhuǎn)速240 r/min因素下，研究?jī)?yōu)化了吸附法一級(jí)種子固定化的培養(yǎng)條件，結(jié)論是40 mL培養(yǎng)基裝0.3 g載體（約為30片HP片）培養(yǎng)14 h。在此基礎(chǔ)上對(duì)二級(jí)種子固定化的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)論是5 h，相比一級(jí)固定化，二級(jí)固定化性能明顯增加。

關(guān)鍵詞：D-核糖；吸附法；種子固定化；

D-核糖是一種具有重要生理功能的五碳糖，在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的用途［1］。D-核糖最主要的生產(chǎn)方法是微生物發(fā)酵法。固定化技術(shù)是將細(xì)胞或酶限制在一定空間范圍內(nèi)并連續(xù)使用的一種方法，固定化細(xì)胞不但可以提高生產(chǎn)效率，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，增加生產(chǎn)能力而且在生產(chǎn)后期易于細(xì)胞的分離、回收［2］。目前固定化細(xì)胞的方法主要有包埋法［3］和吸附法［4］。其中吸附法相比包埋法操作簡(jiǎn)單、相比游離發(fā)酵D-核糖產(chǎn)量高和載體廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)［5］。吸附法固定細(xì)胞主要是在種子培養(yǎng)階段進(jìn)行固定，因此，本文主要對(duì)種子培養(yǎng)階段的條件進(jìn)行了探索，以期達(dá)到提高發(fā)酵產(chǎn)量、縮短發(fā)酵周期。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種

D-核糖生產(chǎn)菌株－轉(zhuǎn)酮酶缺陷型枯草芽孢桿菌。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏7.0，蛋白胨15.0，山梨醇5.0，氯化鈉2.0，磷酸氫二鉀2.0磷酸二氫鉀1.0，瓊脂26，調(diào)pH值7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏5.0，磷酸氫二鉀3.0，磷酸二氫鉀1.0，葡萄糖20.0，調(diào)pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖150.0，硫酸銨7.0，硫酸錳0.05，玉米漿20.0。加碳酸鈣15.0。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)：接菌種于斜面培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)24 h。

種子培養(yǎng)：接一環(huán)菌于裝有40 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，旋轉(zhuǎn)式搖床240 r/min，36℃培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)：以15片聚氨酯泡沫（HP）接入裝有30 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，旋轉(zhuǎn)式搖床240 r/ min，36℃培養(yǎng)。

1.2.2分析測(cè)定方法

菌絲體干重測(cè)定：菌絲體于80℃烘干至恒重后稱量。

2　結(jié)果與討論

固定化細(xì)胞應(yīng)具有穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以在一定的pH值和溫度下，不會(huì)被破壞［3］；雖然提高轉(zhuǎn)速有助于發(fā)酵生產(chǎn)［6］，但是搖床轉(zhuǎn)速有限，只能通過裝液量的優(yōu)化來約束溶氧水平和蒸發(fā)量，進(jìn)而彌補(bǔ)轉(zhuǎn)速不足。所以實(shí)驗(yàn)選定pH值為7.0，溫度36℃，240 r/min進(jìn)行其他因素試驗(yàn)研究。

2.1載體的選擇

作吸附固定化的載體很多，其共同點(diǎn)是空隙率高。雖然多孔玻璃、海綿片、陶瓷片、小磚片、木屑、硅藻土、多孔硅和焦炭都是易得的載體，但是不同的載體對(duì)不同的菌種固定化性能是不同的。本文選取木屑、小磚片、聚氨酯泡沫（HP）做了對(duì)比試驗(yàn)，其中HP片的空隙率可達(dá)90%以上。由于磚片密度較大經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)在瓶底磨損太多，對(duì)固定化細(xì)胞的表征影響很大，所以選擇放棄。以下是HP和木屑的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，以上兩種載體都能吸附細(xì)胞，而且都能生產(chǎn)目的產(chǎn)物，證明吸附法固定可行。但木屑固定化中游離細(xì)胞和固定化的細(xì)胞總和較HP中的小很多，表明木屑對(duì)這種菌的生長(zhǎng)可能有副作用。而HP空隙率的固定化效率和固定化能力都是較大的，而且HP常見、廉價(jià)，所以最終確定HP為吸附固定化載體。

表1　不同載體比較

2.2一級(jí)種子固定化

2.2.1一級(jí)種子固定化時(shí)間的確定

趙艷麗等［5］固定化時(shí)間一般是12 h，本實(shí)驗(yàn)選擇從10 h開始計(jì)數(shù)以“載體吸附細(xì)胞干重/載體干重”為表征［7，8］，以大口三角瓶每瓶裝載體0.202 g種子液40 mL進(jìn)行種子培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖1。

圖1　一級(jí)種子固定化時(shí)間曲線

圖1表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化效果增強(qiáng)，14 h后固定化效果開始降低，雖然到了16 h，固定化效果再次出現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，考慮到時(shí)間、效率，本試驗(yàn)最終確定固定化時(shí)間是14 h。

2.2.2一級(jí)種子固定化載體量?jī)?yōu)化

種子固定化階段載體的多少可能會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)或影響固定化效果，綜合考慮多方面因素，載體量與裝液量應(yīng)該有一個(gè)適合的比例，對(duì)此作了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2　載體量影響圖

圖2表明載體量對(duì)載體的固定性能有一定的影響，載體量增大固定性能下降明顯；而載體量的增加總的固定細(xì)胞數(shù)也會(huì)增加，綜合考慮以上兩點(diǎn)，從圖中可以看出選擇0.3 g載體為宜，這樣既可有較好的固定化性能又可以兼顧到總的固定細(xì)胞量。本試驗(yàn)最終確定固定化載體量為“0.3 g載體/40 mL種子液”。

2.2.3種子固定化裝液量確定

最初，根據(jù)以前做的游離細(xì)胞實(shí)驗(yàn)裝液量數(shù)據(jù)選擇了40mL，在此將保持載體量與裝液量的比不變對(duì)裝液量的時(shí)間曲線進(jìn)行平行擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖3。

圖3　不同裝液量時(shí)間曲線

圖3表明40 mL的裝液量較為合適。最后決定一級(jí)固定化用40 mL培養(yǎng)基，0.3 g載體，培養(yǎng)14 h。

2.3二級(jí)種子固定化

由于是搖瓶培養(yǎng)，在一級(jí)培養(yǎng)轉(zhuǎn)二級(jí)培養(yǎng)時(shí)染菌幾率大，所以其他條件不宜進(jìn)行優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)是以一級(jí)固定化的裝液量和載體量不變只確定二級(jí)種子固定化時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4　二級(jí)種子培養(yǎng)時(shí)間曲線

圖4可見在二級(jí)種子培養(yǎng)初期載體固定性能有所下降，這應(yīng)該是載體與培養(yǎng)基之間存在細(xì)胞量的平衡導(dǎo)致的。二級(jí)固定化時(shí)間較短而且后期固定化效果下降，這應(yīng)該是因?yàn)樽砸约肮潭ɑ筝d體已經(jīng)吸附了大量細(xì)胞，到二級(jí)固定化的后期營(yíng)養(yǎng)不足菌種自溶造成的。為此對(duì)后期的種子剩余液做了鏡檢，觀察有大量細(xì)胞自溶，但此不能說明載體內(nèi)部的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，所以這一現(xiàn)象還需其他方法檢測(cè)。

由于生產(chǎn)D-核糖所用的枯草芽孢桿菌在種子階段成鏈狀生長(zhǎng)，選擇二級(jí)種子固定可以延長(zhǎng)種子在載體空隙中的生長(zhǎng)時(shí)間，使菌體生長(zhǎng)的更加長(zhǎng)而粗壯數(shù)量更多，從而使空隙與菌體之間固定更加牢固，對(duì)固定化效果會(huì)有所加強(qiáng)。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明二級(jí)固定化較一級(jí)固定化固定化性能明顯增加。

3　結(jié)論

3.1本文首先對(duì)吸附載體進(jìn)行了選擇，選擇幾種常見廉價(jià)的載體中做實(shí)驗(yàn)，確定用HP做載體，吸附固定化枯草芽孢桿菌。

3.2文章對(duì)一級(jí)種子固定化進(jìn)行了研究，優(yōu)化了時(shí)間、裝液量、載體量等重要參數(shù)。結(jié)果顯示以40 mL培養(yǎng)基裝0.3 g載體（約為30片HP片）培養(yǎng)14效果最好。

3.3二級(jí)種子固定化在一級(jí)種子固定化參數(shù)基礎(chǔ)上只對(duì)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示二級(jí)種子固定化培養(yǎng)時(shí)間以5 h為益。結(jié)果還表明在固定化后期存在菌體自溶現(xiàn)象。

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Study on fermentation of d-ribose by immobilized cells through adsorption method

HE Shan，WANG Chao-chen，WANG Shu-qing
（Tianjin Bohai Vocational Technical College，Tianjin 300402）

Abstract:Choosing polyurethane foam（HP）as the carrier after optimal screening，studying and optimizing the culture conditions of adsorption method D-ribose level one seeds immobilization，in the factors that pH value of 7.0，temperature 36℃，the rotation rate of shaking table 240 r/min.The result is 40 ml culture medium，installed 0.3 g carrier（about 30 piece of HP piece）and cultured 14 h.Based on this，optimized the culture time of level two seeds immobilization，the conclusion is 5 h，compared with level one immobilization，level two immobilization obviously improves the features.

Key words：D-ribose；adsorption method；seeds immobilization conditions

doi：10.3969/j.issn.1008-1267.2016.01.010

中圖分類號(hào)：TQ929

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1267（2016）01-0028-04

收稿日期：2015-09-15