馬曉燕，何文智，袁天麗，冼嘉嘉，王曉蔓，李少英，劉海波，黎　青（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 法醫(yī)物證司法鑒定所 廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510150）

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廣東漢族人群H19基因上游差異甲基化區(qū)SNP

馬曉燕，何文智，袁天麗，冼嘉嘉，王曉蔓，李少英，劉海波，黎青
（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 法醫(yī)物證司法鑒定所 廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510150）

摘要：目的 調(diào)查廣東漢族人群中H19基因上游差異甲基化區(qū)（differentially methylated region，DMR）的單核苷酸多態(tài)性（SNP）及單倍型。方法 應(yīng)用PIA分型法，以限制性內(nèi)切酶McrBC、HpaⅡ消化基因組DNA分別獲得個(gè)體單親源DNA模板鏈，經(jīng)測序，分別獲得個(gè)體H19基因上游DMR單親源SNP等位基因、基因型及單倍型數(shù)據(jù)。結(jié)果 共檢出13個(gè)SNP（rs10840167、rs2525883、rs12417375、rs4930101、rs2525882、rs2735970、rs2735971、rs11042170、rs2735972、rs10732516、rs2071094、rs2107425、rs4930098）及1個(gè)突變點(diǎn)（g7351c）。所有位點(diǎn)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。除rs12417375位點(diǎn)DP值為0.279，其余12個(gè)SNP DP值在0.446～0.614；g7351c突變點(diǎn)DP值為0.013，提示為南方漢族民族特異性位點(diǎn)。共檢出8種單倍型（命名為單倍型1～8），其中有3種為新發(fā)現(xiàn)的單倍型，其DP、PIC、PE及H分別為0.891、0.714、0.524和0.758。結(jié)論 PIA分型法獲得的H19基因上游DMR SNP位點(diǎn)及其單倍型遺傳標(biāo)記系統(tǒng)具有較高的鑒別能力，在法醫(yī)學(xué)鑒定中具有較好的實(shí)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；多態(tài)性，單核苷酸；DNA甲基化；H19基因；漢族；廣東

H19基因是位于染色體11p15.5區(qū)域印記基因簇中的一個(gè)父源印記基因，其父源等位基因高度甲基化而母源等位基因未甲基化［1-4］，該印記受其上游4kb處差異甲基化區(qū)（differentially methylated region，DMR）的調(diào)控［5-7］。近年其上游DMR中SNP受法醫(yī)遺傳學(xué)研究的青睞。親源印記等位基因（parentally imprinted allele，PIA）分型法可以不依賴家系分析而直接確定等位基因的親本來源，確定個(gè)體的單倍型［8-9］，大大提高某些親子鑒定案件（如單親鑒定或母親與小孩具有相同雜合子基因型）的鑒定效能［10］。目前已報(bào)道［10-13］的

1　材料與方法

1.1樣本

收集廣東漢族149份健康無關(guān)個(gè)體外周血樣，EDTA抗凝。用QIAamp?DNA Blood Mini試劑盒（德國QIAGEN公司）提取DNA，并用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國Thermo scientific公司）測定濃度。根據(jù)DNA的濃度確定擴(kuò)增模板和酶切模板的量。

1.2引物

根據(jù)文獻(xiàn)［4-6］合成擴(kuò)增H19基因上游DMR的4條引物，引物特異性序列見表1，為用于后續(xù)測序，合成時(shí)在正向引物5′端加上通用引物M13F接頭，反向引物5′端加上通用引物M13R接頭。H19SF3和H19R4擴(kuò)增產(chǎn)物長548bp，H19CF2和H19R7擴(kuò)增產(chǎn)物長664bp。

表1　H19基因上游DMR特異性擴(kuò)增引物序列

1.3PIA分型

1.3.1單親源DNA模板制備

用限制性內(nèi)切酶McrBC（美國NEB公司）消化基因組DNA得到149例母源DNA模板，用限制性內(nèi)切酶HpaⅡ（美國NEB公司）消化基因組DNA得到149例父源DNA模板。McrBC消化反應(yīng)終濃度：基因組DNA 40～1000ng，4U McrBC，1mmol GTP，1×BSA，1×Buffer；反應(yīng)條件為37℃消化4h，65℃滅活10min。HpaⅡ消化反應(yīng)終濃度：基因組DNA 40～1000ng，1U HpaⅡ，1×Buffer；反應(yīng)條件為37℃消化4h，80℃滅活20min。

1.3.2PCR擴(kuò)增

選用LA Taq?with GC buffer試劑盒（大連TaKaRa公司）在9700擴(kuò)增儀（美國AB公司）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系中基因組DNA 40～1 000 ng，0.5 U LA Taq，1×GC bufferⅠ，dNTP 0.4mmol，每個(gè)片段上下游引物含量均為0.5μmol。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 40 s，61℃ 40 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.3.3測序

對(duì)298例PIA模板（父源和母源DNA模板各149例）擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。測序引物為通用引物M13F和M13R，測序試劑盒為BigDye Terminator v3.1（美國AB公司），具體方法參照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。測序儀器為3500遺傳分析儀（美國AB公司）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各SNP的基因型頻率、等位基因頻率以及單倍型頻率。用PowerMaker v3.25進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，計(jì)算基因頻率及單倍型頻率。用Modified-Powerstates軟件計(jì)算個(gè)人識(shí)別率（DP）、雜合度（H）、非父排除率（PE）、多態(tài)信息含量（PIC）等群體遺傳學(xué)參數(shù)。使用SPSS 13.0軟件計(jì)算不同群體之間等位基因頻率及單倍型頻率分布的差異。

2　結(jié)果

2.1H19基因上游DMR的SNP分布及群體間差異

廣東漢族149個(gè)無關(guān)個(gè)體樣本中共得到298例單倍型DNA模板（父源單倍型和母源單倍型DNA模板各149例），其H19上游DMR中，共檢出13個(gè)SNP（rs10840167、rs2525883、rs12417375、rs4930101、rs2525882、rs2735970、rs2735971、rs11042170、rs2735972、rs10732516、rs2071094、rs2107425、rs4930098）及1個(gè)突變點(diǎn)（g7351c）。其基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)見表2。所有位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。其中12個(gè)SNP的DP值為0.446～0.614，具有較高的鑒別能力，而rs12417375位點(diǎn)（DP值為0.279）及g7351c突變點(diǎn)（DP值為0.013）的鑒別能力較低。Powermaker軟件分析結(jié)果顯示，多個(gè)位點(diǎn)間處于連鎖不平衡（表3）。

表2　廣東漢族人群H19 基因上游DMR 中SNP 基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)（n=298）

表3　廣東漢族人群H19 基因上游DMR 中13 個(gè)SNP 位點(diǎn)的連鎖不平衡分析（n=298）

將廣東漢族人群與已報(bào)道的其他群體的H19基因上游DMR多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，廣東漢族與沈陽漢族［14］、北方朝鮮族［15］人群在H19上游DMR中的13個(gè)SNP位點(diǎn)中，有3個(gè)位點(diǎn)（rs2525883、rs2735970、rs2107425）的分布存在差異（P＜0.05），而與武漢漢族［10］人群在H19上游DMR中已報(bào)道的4個(gè)SNP位點(diǎn)中，有2個(gè)位點(diǎn)（rs2525882、rs11042170）的分布存在差異（P＜0.05）。g7351c突變點(diǎn)在廣東、武漢漢族人群中均檢出，且其頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在已報(bào)道的中國其他地區(qū)與民族人群中未檢見。

2.2H19基因上游DMR單倍型分布及群體間差異

298例單倍型DNA模板樣本的分析結(jié)果顯示，廣東漢族人群H19基因上游DMR 13個(gè)SNP位點(diǎn)及1個(gè)突變點(diǎn)（g7351c）組成8種單倍型，根據(jù)其頻率從高到低依次命名為單倍型1～8，單倍型序列、頻率及與其他群體間的比較結(jié)果見表4～5。經(jīng)計(jì)算，廣東漢族H19基因上游DMR單倍型遺傳標(biāo)記的DP為0.891，H為0.758，PIC為0.714，PE為0.524。

表4　廣東漢族人群H19上游DMR單倍型序列

表5　H19基因上游DMR單倍型頻率在各群體間的比較

比較廣東漢族人群與東北漢族［14］、北方朝鮮族［15］人群的H19基因上游DMR單倍型分布，發(fā)現(xiàn)本研究的1號(hào)單倍型在廣東漢族人群中的頻率比在其他2個(gè)人群中的頻率高，而2號(hào)單倍型則相反，6～8號(hào)單倍型在其他兩個(gè)人群中未發(fā)現(xiàn)?；?～5個(gè)單倍型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，廣東漢族與沈陽漢族［14］和朝鮮族［15］的單倍型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

3.1PIA分析H19上游DMR單倍型的基本原理

H19的結(jié)構(gòu)特征為PIA分型提供思路。H19基因上游DMR在父源和母源片段中發(fā)生差異甲基化，父源片段高度甲基化，母源片段未甲基化。HpaⅡ是一種甲基化敏感性限制內(nèi)切酶，對(duì)哺乳動(dòng)物基因組DNA CpG甲基化敏感，可以識(shí)別序列（CCGG）中非甲基化的胞嘧啶，并將其切割，而對(duì)甲基化的胞嘧啶不產(chǎn)生作用，因此，以HpaⅡ酶消化基因組DNA非甲基化鏈，而甲基化鏈得以保留（H19基因上游DMR父源鏈得以保留）。而核酸內(nèi)切酶McrBC則識(shí)別甲基胞嘧啶［識(shí)別位點(diǎn)5′-...PumC（N40-3000）PumC...3′］，并在兩個(gè)甲基胞嘧啶之間進(jìn)行切割。以McrBC酶消化基因組DNA甲基化鏈，而非甲基化鏈得以保留（H19基因上游DMR母源鏈得以保留）。通過對(duì)單親源鏈的擴(kuò)增測序，即可獲得人群中目的片段單倍型的數(shù)據(jù)。

3.2H19基因上游DMR中SNP位點(diǎn)及單倍型分布的群體間差異

H19基因上游DMR在序列號(hào)AF125183堿基位置7149～8217區(qū)域已報(bào)道的有25個(gè)SNP位點(diǎn)（包括11個(gè)民族特異性位點(diǎn)）［13-15］。其中中國人群已報(bào)道的有13個(gè)SNP位點(diǎn)和1個(gè)突變點(diǎn)（g7351c），在本研究中均全部檢出。不同群體間數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，某些SNP位點(diǎn)在廣東漢族人群與中國其他人群中的多態(tài)性分布存在差異，這些差異可能與地域、環(huán)境、生活習(xí)慣、聚居、婚配方式以及遷移歷史的不同有關(guān)，也提示了對(duì)某種遺傳標(biāo)記進(jìn)行不同人群頻率調(diào)查和比對(duì)的必要性。此外，Nakayashiki等［12］指出g7351c可能為中國人群特異性位點(diǎn)，但除Huang等［10］早年在對(duì)武漢人群H19FR片段（約550 bp）研究中發(fā)現(xiàn)該突變點(diǎn)外，其他已報(bào)道［12，14-15］的中國（北方）群體中并未檢出，提示該點(diǎn)可能為中國南方漢族人群特異性突變點(diǎn)，而本研究在149例個(gè)體中觀察到1例g7351c的突變點(diǎn)（與Huang等［10］報(bào)道的頻率一致），也進(jìn)一步印證了這種觀點(diǎn)，但鑒于樣本量少，后續(xù)工作將增加樣本量進(jìn)行更多次減數(shù)分裂的觀察研究。

經(jīng)PIA分析，廣東漢族人群H19基因上游DMR檢出的13個(gè)SNP位點(diǎn)及1個(gè)突變點(diǎn)共組成8種單倍型（1～8號(hào)），涵蓋了該區(qū)域中已報(bào)道中國人群全部SNP單倍型（1～5號(hào)）。其中，2號(hào)單倍型在廣東漢族群體中的頻率（0.285）比在中國北方群體中的頻率（0.419）低，支持Nakayashiki等［13］提出的該單倍型頻率由南自北逐漸增高，提示遷徙模式（migration-suggestive patterns）的觀點(diǎn)。7號(hào)單倍型來源樣本是McrBC酶處理后的母源單倍型，與Nakayashiki等［12］報(bào)道的3號(hào)單倍型（基于13個(gè)SNP位點(diǎn)）一致，該單倍型出現(xiàn)于蒙古、泰國、緬甸、土耳其、德國、非洲等人群［13］，而在其他亞洲地區(qū)人群中未見到，因缺乏母系樣本，本研究未對(duì)該個(gè)體進(jìn)行家系分析，在不考慮突變的情況下，我們猜測該單倍型可能存在個(gè)體遷徙，后續(xù)工作可追蹤該個(gè)體進(jìn)行家系調(diào)查，以期為遷徙模式的研究豐富數(shù)據(jù)。6號(hào)單倍型由1號(hào)單倍型的7351G到C的突變而來，提示該單倍型具有南方漢族人群特異性特征，由于未進(jìn)行家系分析，所以該單倍型是否遺傳給子代尚不能夠確定。8號(hào)單倍型由2號(hào)單倍型的rs2107425回退突變（A到G）產(chǎn)生，但遺憾的是，后續(xù)的家系分析發(fā)現(xiàn)該單倍型并未遺傳給子代。

3.3法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值和后續(xù)工作展望

印記基因遺傳標(biāo)記比普通二倍體遺傳標(biāo)記在個(gè)體識(shí)別和某些疑難親權(quán)鑒定案例（如單親、母子分型相同的雜合子家系以及同胞和半同胞的鑒定）中更具優(yōu)勢，親緣特異性的單倍型分析可直接通過單倍型檢測進(jìn)行鑒定，若單倍型同源性不一致可直接排除，本研究通過計(jì)算H19基因上游DMR單倍型頻率求得其DP、PIC、PE及H分別為0.891、0.714、0.524和0.758，說明該遺傳標(biāo)記系統(tǒng)在法醫(yī)學(xué)鑒定中具有較好的實(shí)用價(jià)值。另外，有研究［11］表明，印記基因DMR在法醫(yī)學(xué)不同組織中的甲基化模式具有差異，尤其是精液樣本因精子形成過程中甲基化標(biāo)記的消除或重建而表現(xiàn)為一個(gè)復(fù)雜的甲基化模式，會(huì)出現(xiàn)與其他體細(xì)胞組織相反的甲基化狀態(tài)。故將不同組織與樣本（尤其是生殖細(xì)胞樣本）納入PIA分型的研究是有必要的。

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（本文編輯：柳燕）

中圖分類號(hào)：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.006

文章編號(hào)：1004-5619（2016）03-0184-05

基金項(xiàng)目：上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KF1305）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201300000095）；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B022000023）

作者簡介：馬曉燕（1985—），女，碩士，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)工作及DNA多態(tài)性研究；E-mail：yalena_m@foxmail.com

通信作者：黎青，女，博士，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)鑒定和研究；E-mail：81292522@163.comH19基因上游DMR中共有25個(gè)SNP（其中11個(gè)具有民族特異性的突變點(diǎn)）及21種單倍型，這些SNP及單倍型在人群中的分布存在地區(qū)及種族的差異性［13-15］。本研究用PIA分型法分別制備廣東漢族群體H19基因上游DMR中的父源和母源DNA模板鏈，結(jié)合DNA測序技術(shù)檢測其父源和母源SNP等位基因，調(diào)查該群體中H19基因上游DMR的SNP位點(diǎn)、單倍型的遺傳多態(tài)性及群體遺傳學(xué)參數(shù)，為PIA分型在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)遺傳數(shù)據(jù)。

收稿日期：（2015-10-16）

SNP in Differentially Methylated Region Upstream of H19 Gene in Guangdong Han Population

MA Xiao-yan，HE Wen-zhi，YUAN Tian-li，XIAN Jia-jia，WANG Xiao-man，LI Shao-ying，LIU Hai-bo，LI Qing
（Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes，Institute of Forensic Identification，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong 510150，China）

Abstract：Objective To investigate the single nucleotide polymorphism （SNP）and haplotypes in differentially methylated region（DMR）upstream of H19 gene in Guangdong Han population.Methods The PIA typing and restriction enzyme McrBC and HpaⅡ were used to digest the genomic DNA and obtain the individual uniparental DNA template strand.The data of uniparental SNP alleles，genotypes and haplotypes in DMR upstream of H19 gene were obtained by sequencing.Results A total of 13 SNPs（rs10840167，rs2525883，rs12417375，rs4930101，rs2525882，rs2735970，rs2735971，rs11042170，rs2735972，rs10732516，rs2071094，rs2107425，and rs4930098）and one mutation locus（g7351c）were found.All loci followed the Hardy-Weinberg equilibrium （P＞0.05）by statistical analysis.Except for rs12417375（DP=0.279）locus，the DP of remaining 12 SNPs were 0.446-0.614，and the g7351c mutation locus（DP=0.013）was the particular loci of the Southern Chinese Han population.Eight haplotypes（designated as haplotype 1-8）were detected，in which 3 haplotypes had not yet been reported and the DP，PIC，PE and H were 0.891，0.714，0.524 and 0.758，respectively.Conclusion Obtained by PIA typing，the SNP in DMR upstream of H19 gene and its haplotypes genetic marker system have a high determination power and show a good practical value in forensic identification.

Key words：forensic genetics；polymorphism，single nucleotide；DNA methylation；H19 gene；Han nationality；Guangdong