蓋江濤+++沈建凱++王鵬

摘要：苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanine ammonia-lyase [EC：4.3.1.24]）存在于各種植物和部分微生物中，是與植物抗病性相關(guān)的關(guān)鍵酶，具有重要的植物生理意義。采用BLASTP的方法，依托全基因組數(shù)據(jù)庫，獲得了擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]、水稻（Oryza sativa L.）、玉米（Zea mays Linn.）、小麥（Triticum aestivum Linn.）、谷子[Setaria italica （L.） P. Beauv.]、大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]6種植物中的PAL基因家族共45條序列，對其進行了系統(tǒng)進化分析、生物信息學(xué)分析等。分析結(jié)果顯示：單子葉植物與雙子葉植物分別聚集在不同的分支，說明單子葉植物水稻、玉米、小麥、谷子親緣關(guān)系較近，雙子葉植物擬南芥、大豆親緣關(guān)系較近，而單子葉植物與雙子葉植物親緣關(guān)系較遠，也說明PAL基因的分化在單子葉植物和雙子葉植物分化前形成；酸性蛋白質(zhì)占93.3%，穩(wěn)定性蛋白占97.8%，有信號肽的蛋白占2.2%，有導(dǎo)肽的蛋白占4.4%，所有蛋白均為有明顯跨膜現(xiàn)象的親水性蛋白；所有PAL基因亞細胞定位于細胞質(zhì)中，都有蛋白活性位點。分析結(jié)果為進一步研究作物中PAL代謝機理提供理論支持。

關(guān)鍵詞：苯丙氨酸解氨酶；PAL；基因家族；氨基酸

中圖分類號： Q78文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0045-05

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC：4.3.1.24）存在于各種植物和少數(shù)微生物中，是目前研究較多的與植物抗病性相關(guān)的酶，與植物抗毒素及酚類化合物的形成密切相關(guān)[1-2]。PAL不能直接抵御病蟲害，但在植物體內(nèi)通過苯丙烷類途徑進一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、黃酮、異黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物來增強植株的抗性[3-4]。

1961年，Koukol等首次記錄了高等植物中PAL酶的提取分離[5]，此后關(guān)于這種酶的研究迅速展開，目前PAL已從水稻[6]、小麥[6]等多種植物中得到分離純化，并對擬南芥[7]、水稻[8]等植物PAL基因進行了cDNA克隆和序列分析。

研究發(fā)現(xiàn)，不同種植物中PAL活性不同，如水稻葉的PAL活性遠比小麥的高[6]。在同一株植物中，不同的組織部位PAL活性也不同，一般來說越嫩的部位PAL活性越高[9]，如楊樹PAL活性在正在發(fā)育的木質(zhì)部、嫩莖和嫩葉中最高[10]。免疫細胞化學(xué)研究顯示PAL合成于柵欄細胞和海綿細胞，主要在細胞質(zhì)和葉綠體內(nèi)[11]。組織印跡顯示PAL的mRNA常出現(xiàn)在表皮和微管附近的組織細胞中[12]。

PAL基因參與復(fù)雜的植物防御體系[13]，比如受傷害、病原菌侵染及光照（紅光、白光等）時，PAL與植物抗性表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。玉米大斑病[14]、小斑病[15]、葉斑病[16]，小麥赤霉病[17]，水稻抗UV-B輻射及稻瘟病[18]、大豆疫霉根腐病[19]等的研究中都證實感染病原菌的植物PAL活性增強。

在擬南芥中，基因組編碼4個PAL基因，分別為PAL1 （AT2G37040）、PAL2（AT3G53260）、PAL3（AT5G04230）、PAL4（AT3G10340）。用過量的Cu處理植物顯示PAL活性增加，當(dāng)同時再增加Si的含量時，PAL1、PAL2、PAL3呈現(xiàn)出相似的基因表達模式，表達水平均降低；而PAL4無論是否增加Si的含量，都沒有引起PAL4表達水平降低。說明PAL基因?qū)χ参锏姆巧锩{迫有作用，但是4個基因表達模式有區(qū)別[20]。

本研究以已知PAL基因功能的擬南芥[Arabidopsis thaliana （Linnaeus） Heynhold]的PAL基因為參考，以禾本科（Poaceae）植物水稻（Oryza sativa Linnaeus）、玉米（Zea mays Linnaeus）、小麥（Triticum aestivum Linnaeus）、谷子[Setaria italica （Linnaeus） P. de Beauvois]、豆科植物大豆[（Glycine max （Linnaeus） Merrill]作為研究對象，以其全基因組數(shù)據(jù)庫為依托，通過BLAST的方法獲得了這5種植物PAL基因家族的全部序列，通過系統(tǒng)發(fā)育分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析等生物信息學(xué)方法分析PAL基因家族，比較主要作物中PAL基因的特性，為推動主要作物中PAL基因功能研究提供理論支持。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫搜索

從phytozome V9.1[21] （http：//www.phytozome.net）中搜索得到擬南芥、水稻、玉米、谷子、大豆的PAL基因信息，從gramene（http：//ensembl.gramene.org/Triticum_aestivum/Info/Index）中搜索得到小麥的PAL基因信息，并下載數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列。

1.2多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

用Probcons[22]軟件對所得數(shù)據(jù)進行多序列比對，并于MEGA6.0[23]中對比對結(jié)果進行手動調(diào)整。用MrBayes 3.2.2[24]對調(diào)整后的序列進行系統(tǒng)聚類分析，設(shè)置1 000 000代檢測，取樣頻率為1 000，4條Markov鏈，其余參數(shù)均為軟件默認(rèn)值，運行2次，分裂頻率（split frequencies）小于0.01時終止運行。所得的系統(tǒng)發(fā)育進化樹在Figtree v1.4.0軟件中進行查看、編輯。

1.3蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

采用ProtParam tool[25] （http：//web.expasy.org/protparam/）在線工具預(yù)測分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，應(yīng)用TMpred[26]程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMpred-form.html）在線分析來預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向，亞細胞定位應(yīng)用Cell-PLoc 2.0 package[27]軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行在線分析。用TargetP 1.1 Server[28] （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在線預(yù)測氨基酸序列導(dǎo)肽，應(yīng)用signalP 4.1 server[29] （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）中完成蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測。活性位點運用在線分析軟件Expasy[30] （http：//prosite.expasy.org/）進行分析。

1.4擬南芥PAL基因生育期芯片數(shù)據(jù)表達模式的分析

從Plant Expression Database[31]網(wǎng)站的擬南芥數(shù)據(jù)庫（http：//www.plexdb.org/plex.php？database=Arabidopsis）中下載RMA文件，提取擬南芥的4條PAL基因（AT2G37040、AT3G53260、AT5G04230、AT3G10340）分別在各生育期組織[（子葉（7 d）、下胚軸（7 d）、幼苗（7 d）、幼葉（10 d）、根（7 d）、莖（17 d）、花（>21 d）、雄蕊（>21 d）、雌蕊（>21 d）、花粉（6周）、植株（21 d）]的表達情況，結(jié)果用gplots軟件包中的heatmap.2軟件繪制熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1PAL基因家族的系統(tǒng)進化分析

通過BlastP的方法，去掉冗余序列，共得到45條氨基酸序列，其中擬南芥4條、水稻5條、玉米5條、谷子4條、小麥20條、大豆7條。對45條編碼PAL的氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）。分析結(jié)果顯示這45條PAL基因家族序列聚為明顯的2支（Ⅰ、Ⅱ），單子葉植物綱禾本科的水稻、玉米、小麥、谷子聚為一支（Ⅰ），雙子葉植物綱的擬南芥、大豆聚為一支（Ⅱ）。說明在進化過程中，PAL基因的分化在單子葉植物和雙子葉植物分化前形成；且主要作物單子葉植物綱禾本科的水稻、玉米、小麥、谷子的親緣關(guān)系較近，它們與雙子葉植物綱的擬南芥、大豆親緣關(guān)系較遠。

在已知的擬南芥PAL基因功能的前提下，可以推測出與擬南芥最近的分支上的序列可能與擬南芥中PAL基因具有相似功能。小麥、大豆2個物種的PAL基因在分支上聚集得相對集中，推測他們在物種形成中具有重要的生理功能。

2.2PAL蛋白的理化性質(zhì)分析

對45條氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示：除Traes_1AS_6BDC65775、Traes_4AL_892C47ED5、Traes_2AS_EC4ADE04E為堿性蛋白（理論等電點pI>7）外，其余蛋白均為酸性蛋白質(zhì)（理論等電點pI<7）（圖2）；根據(jù)Guruprasad等的方法[32]，除Traes_1AS_6BDC65775為不穩(wěn)定性蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)Ⅱ>40）外，其余蛋白均為穩(wěn)定性蛋白（Ⅱ<40） （圖3）；相對分子量除Traes_1BS_A3B2A0DAD為46.97 ku、Si009345m為91.20 ku外，其余位于65.49～78.34 ku之間（圖4），與之前報道的分子量一般在55～88 ku之間一致[33]；所有蛋白都有明顯跨膜現(xiàn)象；除Traes_1AS_6BDC65775有信號肽（圖5）外，其余蛋白均無信號肽；僅小麥基因Traes_1AS_6BDC65775、Traes_2AS_EC4ADE04E具有葉綠體轉(zhuǎn)運肽（Chloroplast transit peptide，CTP），其余氨基酸序列均沒有導(dǎo)肽。

所有蛋白均為親水性蛋白（GRAVY<0）。半衰期一致表現(xiàn)為：序列的N-端為甲硫氨酸（Met），在哺乳動物的活體中半衰期為30 h，在酵母活體中半衰期大于20 h，在大腸桿菌的活體中半衰期大于10 h。

2.3PAL的結(jié)構(gòu)分析

所有PAL基因亞細胞定位于細胞質(zhì)中。活性位點分析得出：所有基因都有活性位點，Glyma10g35381.1、Glyma20g32135.1的活性位點為GTITASGDLvPLSyvaG、LOC_Os02g41670.1、GRMZM2G170692_T01、GRMZM2G334660_T01，Si016475m、Si019385m的活性位點為GTVTASGDLvPLSyiaG，其余氨基酸序列的活性位點為GTITASGDLvPLSyiaG，具有活性位點的蛋白均屬于PAL絲氨酸（Ser）酶，屬于PAL基因家族的特征序列。

2.4擬南芥PAL基因生育期芯片中的表達模式

根據(jù)擬南芥各生育期芯片可以得出其4條PAL基因的表達模式。由圖6可知，AT3G53260和AT2G37040在花粉（6周）中無明顯表達，在其余組織中均有較強表達；AT3G10340主要在雄蕊（>21 d）、花（>21 d）、根（7 d）中有較強表達，在其他組織中無明顯表達；AT5G04230在子葉（7 d）中有較弱表達，在其余各組織中均無明顯表達。

3結(jié)論與討論

PAL是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應(yīng)的酶，是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，苯丙烷類代謝途徑的產(chǎn)物在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用，而這些物質(zhì)的含量總是與PAL的活性密切相關(guān)，因此PAL對植物有著非常重要的生理意義。

本研究對擬南芥、水稻、玉米、小麥、谷子和大豆6種植物中共45條PAL基因家族蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，單子葉植物水稻、玉米、小麥、谷子的基因聚集在一支，雙子葉植物擬南芥、大豆基因聚集在一支，單子葉植物與雙子葉植物分別聚集在不同的分支，說明單子葉植物水稻、玉米、小麥、谷子親緣關(guān)系較近，雙子葉植物擬南芥、大豆親緣關(guān)系較近，單子葉植物與雙子葉植物親緣關(guān)系相對較遠，說明以PAL基因家族構(gòu)建系統(tǒng)進化樹能夠準(zhǔn)確地反映植物物種之間的親緣關(guān)系及進化關(guān)系，也說明在進化過程中，PAL基因的分化在單子葉植物和雙子葉植物分化前形成；同時，與擬南芥最近的分支上共有7條大豆基因和1條小麥基因，推測它們可能屬于PAL基因家族；在已知的擬南芥的PAL基因功能的前提下，可以推測出與擬南芥最近的分支上的序列可能與擬南芥中PAL基因具有相似功能。

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，酸性蛋白質(zhì)占93.3%，與之前報[JP2]道的PAL是一種酸性蛋白一致[33-35]。穩(wěn)定性蛋白占978%，[JP]有信號肽的蛋白占2.2%，有導(dǎo)肽的蛋白占4.4%，所有蛋白均為有明顯跨膜現(xiàn)象的親水性蛋白；僅小麥基因 Traes_1AS_6BDC65775、Traes_2AS_EC4ADE04E具有葉綠體轉(zhuǎn)運肽，其余氨基酸序列均沒有導(dǎo)肽。說明大多數(shù)蛋白為非分泌性蛋白，它們由游離的核糖體合成，在細胞質(zhì)內(nèi)參與生化反應(yīng)，在細胞內(nèi)代謝過程中發(fā)揮重要作用。

結(jié)構(gòu)分析結(jié)果得出，所有氨基酸序列均有蛋白活性位點，均屬于PAL絲氨酸（Ser）酶，具有PAL基因家族的特征序列，初步認(rèn)為這些基因?qū)儆赑AL基因家族。同時，亞細胞定位發(fā)現(xiàn)所有PAL基因都定位于細胞質(zhì)中，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致，進一步說明PAL基因在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。

擬南芥PAL基因生育期芯片表達模式分析結(jié)果表明，AT3G53260和AT2G37040在子葉（7 d）、下胚軸（7 d）、幼苗（7 d）、幼葉（10 d）、根（7 d）、莖（17 d）、花（>21 d）、雄蕊（>21 d）、雌蕊（>21 d）等中均有較強表達，在花粉（6周）中無明顯表達；AT3G10340主要在雄蕊（>21 d）、花（>21 d）、根（7 d）中有較強表達，在子葉（7 d）、下胚軸（7 d）、幼苗（7 d）、幼葉（10 d）、莖（17 d）、雌蕊（>21 d）、花粉（6周）中表達較弱；AT5G04230在子葉（7 d）中有較弱表達，在其余各組織中均表達較弱。說明擬南芥中PAL基因的表達模式呈現(xiàn)明顯的組織特異性，為本研究中主要作物的PAL基因表達研究提供參考。

目前，雖有關(guān)于主要作物中PAL基因的研究，但都是對單個基因的克隆，尚未發(fā)現(xiàn)有從主要作物中PAL基因家族層面的報道。本研究選取了5種主要作物的PAL基因家族為研究對象，對其基因家族系統(tǒng)進化、理化性質(zhì)、定位、結(jié)構(gòu)等進行了分析，對今后在主要作物中研究PAL基因的時空表達模式及功能，增強多個基因的協(xié)同表達，更好地利用 PAL對主要作物進行改造，從而增強主要作物的抗病性有重要意義。

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