吳秀林+丁煒東++曹哲明++劉旭++邴旭文

摘要：DNA甲基化是一種重要的 DNA 修飾方式，它能在不改變 DNA一級結(jié)構(gòu)的情況下調(diào)控基因的表達(dá)，能夠維持正常的細(xì)胞功能，在胚胎發(fā)育、遺傳印記中起重要作用。以黃鱔為對象，采用限制性內(nèi)切酶-PCR檢測特定DNA 片段是否發(fā)生甲基化的方法，研究不同溫度、pH值、光照周期條件下DMRT基因在各組織中的甲基化差異。用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶HpaⅡ酶切黃鱔的性腺、腎、脾、肝、腸等5個組織，根據(jù)已知的DMRT2、DMRT3、DMRT4 基因序列設(shè)計(jì)特異的引物擴(kuò)增酶切產(chǎn)物，并設(shè)置未酶切對照組，用1%瓊脂糖檢測，分析差異條帶，若未酶切組泳道出現(xiàn)條帶，酶切組泳道也出現(xiàn)條帶則判定為陽性結(jié)果，否則判定為陰性結(jié)果。結(jié)果表明：不同生態(tài)因子條件下，在5個組織中DMRT2-FR2擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均表現(xiàn)為陽性結(jié)果；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均表現(xiàn)為陰性結(jié)果，說明這4個序列中位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)非常穩(wěn)定，環(huán)境因子的小幅變化對其影響不大。

關(guān)鍵詞：黃鱔；溫度；光照；甲基化

中圖分類號： S966.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0060-04

收稿日期：2015-04-30

基金項(xiàng)目：江蘇省科技支撐計(jì)劃 （編號：BE2013315）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) （編號：2015JBFM06）；江蘇省自然科學(xué)基金 （編號：BK2011184）。

作者簡介：吳秀林（1990—），女，重慶人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種研究。E-mail：764859546@qq.com。

通信作者：邴旭文，研究員，主要從事特種水產(chǎn)養(yǎng)殖與育種研究。E-mail：bingxw@ffrc. cn。黃鱔（Monopterus albus）是重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，隸屬硬骨魚綱輻鰭亞綱合鰓目合鰓科黃鱔屬，其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富，具有較高的食用價值、藥用價值。黃鱔多生活在河道、湖泊、溝塘等水體中，我國的珠江流域、長江流域盛產(chǎn)黃鱔。泰國、印度尼西亞等國也有黃鱔分布[1]。研究發(fā)現(xiàn)，黃鱔繁殖比較特殊，具性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，一般經(jīng)歷雌性發(fā)育階段—間性發(fā)育階段—雄性發(fā)育階段，這種獨(dú)特的生理現(xiàn)象使得黃鱔成為研究探討魚類性別控制機(jī)理的極好材料[2]。DMRT基因家族成員的典型特征是具有一個保守的DM結(jié)構(gòu)域，DM 是一個靠特殊的鋅指結(jié)構(gòu)連接DNA 的結(jié)構(gòu)域，通過調(diào)節(jié)目的基因轉(zhuǎn)錄參與發(fā)育調(diào)節(jié)過程[3]。目前，已在多種魚類體內(nèi)檢測到 DMRT 家族基因[4]。DMRT基因普遍被認(rèn)為與性別分化有關(guān)，如DMRT1、DMRT2、DMRT3與雄性性別分化密切相關(guān)，對精巢正常發(fā)育有重要作用。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠DMRT3參與性腺、腦與脊髓等的發(fā)育，且在雄性中比雌性的表達(dá)量高[3]。Kondo等在青鳉（O. latipes）成體精巢中檢測到有DMRT3的表達(dá)，并且在其成體精巢、卵巢等器官中發(fā)現(xiàn)有DMRT2和DMRT4的表達(dá)，推測DMRT2、DMRT3和DMRT4可能參與青鳉精子的發(fā)生[5]。王佳等通過對鯽 DMRT3 基因的克隆和表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn) DMRT3可能在早期器官發(fā)生和雄性性腺發(fā)育調(diào)控中起作用[6]。環(huán)境因子對魚類的生長、攝食、代謝、生殖以及內(nèi)分泌等產(chǎn)生間接而廣泛的影響[7]。阮國良等以雌性幼鱔為對象，研究不同光照周期對其生長和性腺發(fā)育的影響，結(jié)果表明，黃鱔在黑暗狀態(tài)下其生長和性腺發(fā)育均得到改善[8]。Navarro-Martín等研究發(fā)現(xiàn)，溫度可刺激歐洲鱸魚（Dicentrarchus labrax）性別轉(zhuǎn)化并可影響性別比例，但影響機(jī)制尚不明確[9]。表觀遺傳學(xué)是指在不改變DNA序列的情況下，基因的表達(dá)產(chǎn)生可遺傳變異。DNA甲基化是一種與基因抑制相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分[10]。DNA甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNA Mtase）催化，S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供體，在胞嘧啶的第5 位碳原子上加上一甲基基團(tuán)形成甲基化脫氧胞嘧啶的共價修飾過程[11]，是最常見的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄后修飾方式之一，在基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[12]。Jabbari等通過比較42種脊椎動物體內(nèi)5-甲基胞嘧啶的甲基化程度，得出魚類和兩棲動物機(jī)體甲基化是鳥類和哺乳動物的2倍，且CPG比例前者較高[13]。Varriale等研究對比了南極與熱帶魚類機(jī)體甲基化程度，結(jié)果表明，南極魚類甲基化程度明顯高于熱帶魚類，由此推斷動物機(jī)體甲基化程度與其體溫相關(guān)[14]。本研究探討了不同溫度、pH值、光照周期條件下，DMRT基因在黃鱔各組織中的甲基化差異，旨在為黃鱔性別調(diào)控研究提供一種分子學(xué)角度的方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動物試驗(yàn)所用黃鱔來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院南泉試驗(yàn)基地，對養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行單因素控制，分別控制養(yǎng)殖水體溫度、pH值、光照時間3個生態(tài)因子。每個生態(tài)因子設(shè)置3個梯度試驗(yàn)組，每個梯度試驗(yàn)組設(shè)置2個平行，每個平行養(yǎng)殖4條黃鱔；設(shè)置1個空白對照組，空白對照組設(shè)置2個平行，每個平行養(yǎng)殖4條黃鱔。水體溫度分別為25、28、31 ℃；pH值分別為6.5、7.5、8.5；光照時間分別為8、10、12 h。總樣本數(shù)為80條黃鱔，雌雄各半。

1.1.2試驗(yàn)儀器22331 Hamburg PCR儀（Eppendorf公司），低溫離心機(jī)（Sopvall公司），紫外分光光度計(jì)（Eppendorf公司），無菌操作臺，瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)，高壓濕熱滅菌鍋，水浴鍋，電熱恒溫干燥箱，電子天平，電泳儀及電泳槽，各種型號加樣槍，微波爐，烘箱，恒溫振蕩器，-70 ℃超低溫冰箱，4 ℃ 冰箱。

1.1.3試驗(yàn)試劑 去離子水、70%乙醇、STE緩沖液、Tris-Cl飽和酚、蛋白酶K、三氯甲烷、異丙醇、TaKaRa LA TaqTM、HpaⅡ、Marker DL2000、10×Loading Buffer、EB、50×TAE Buffer、瓊脂糖。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取取黃鱔各組織迅速將其磨碎，加入500 μL STE緩沖液和10 μL蛋白酶K于55 ℃下3～4 h，用Tris-Cl飽和酚、三氯甲烷各抽提1次，取上清液并加入等體積的異丙醇，混勻后放于4 ℃冰箱過夜，12 000 r/min離心 10 min，棄上清，用300 μL 70%乙醇洗沉淀2次，加入100 μL ddH2O溶解，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的完整性，將樣品儲存在-70 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期工作中，根據(jù)已知的DMRT2、DMRT3、DMRT4 基因啟動子區(qū)富含 CpG的序列，分別設(shè)計(jì)5對引物：DMRT-F1、DMRT-R1，DMRT-F2、DMRT-R2，DMRT-F3、DMRT-R3，DMRT-F4、DMRT-R4 以及 DMRT-F5、 DMRT-R5，經(jīng)過篩選比較，發(fā)現(xiàn)用DMRT2-FR2、DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物能擴(kuò)增出較好的條帶。所以本試驗(yàn)采用DMRT2-FR2、DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物（表1）。

1.2.3黃鱔基因組DNA的酶切將提取的DNA產(chǎn)物中加入10 U/μL HpaⅡ酶0.5 μL，于37 ℃水浴中酶切4 h（表2）。

1.2.4黃鱔DMRT基因酶切產(chǎn)物的擴(kuò)增及檢測酶切產(chǎn)物PCR體系：10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Taq酶 0.25 μL，正反引物各0.5 μL，DNA模板 1 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，59 ℃（60 ℃）45 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；最后4 ℃保存。上述PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，置于紫外分光光度計(jì)下觀察，拍照記錄結(jié)果并對結(jié)果進(jìn)行甲基化位點(diǎn)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同溫度下DMRT基因的酶切結(jié)果

水溫分別控制為25、28、31 ℃，取黃鱔性腺、腎臟、肝臟、脾臟、腸等5個組織的基因組DNA用DMRT2-FR2引物擴(kuò)增后，酶切組和未酶切組均有條帶，表明DMRT2-FR2擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均是甲基化的；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物擴(kuò)增后，未酶切組有條帶，酶切組沒有出現(xiàn)條帶，說明這3個擴(kuò)增片段中的位點(diǎn)均是陰性結(jié)果。圖1表示，水溫為28 ℃下黃鱔肝基因組用DMRT4-FR2引物擴(kuò)增后的酶切結(jié)果。表3表示不同溫度下黃鱔各組織的甲基化統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.2不同pH值下黃鱔各組織DMRT基因的酶切結(jié)果

水體pH值分別控制為6.5、7.5、8.5環(huán)境下，黃鱔性腺、腎臟、肝臟、脾臟、腸等5個組織的基因組DNA用DMRT3-FR2引物擴(kuò)增后，酶切組和未酶切組均有條帶，表明DMRT3-FR2擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均出現(xiàn)陽性結(jié)果；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物擴(kuò)增后，未酶切組有條帶，而酶切組沒有出現(xiàn)條帶，說明這3個擴(kuò)增片段中的位點(diǎn)均出現(xiàn)陰性結(jié)果。圖2表示pH值為6.5條件下黃鱔性腺基因組用DMRT3-FR2引物擴(kuò)增后的酶切結(jié)果。表4表示不同pH值下黃鱔各組織的甲基化統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.3不同光照周期下DMRT基因的酶切結(jié)果

養(yǎng)殖網(wǎng)箱每天光照時間控制在8、10、12 h環(huán)境下，黃鱔性腺、腎臟、肝臟、脾臟、腸等5個組織的基因組DNA用DMRT3-FR2引物擴(kuò)增后，酶切組和未酶切組均有條帶，表明DMRT3-FR2擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均表現(xiàn)為陽性結(jié)果；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物擴(kuò)增后，未酶切組有條帶，酶切組沒有出現(xiàn)條帶，說明這3個擴(kuò)增片段中的位點(diǎn)均變現(xiàn)為陰性結(jié)果。圖3表示光照時間為10 h下黃鱔腎臟基因組用DMRT4-FR3引物擴(kuò)增后的酶切結(jié)果，表5表示不同光照時間下黃鱔各組織的甲基化統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

對比表3、表4、表5可以得出，不同生態(tài)因子條件下黃鱔各組織的DMRT基因酶切后的擴(kuò)增結(jié)果是一致的，DMRT3-FR2擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均是甲基化的；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3的擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均是去甲基化的。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)將PCR引物設(shè)計(jì)在酶切位點(diǎn)的兩側(cè)，DNA被酶切后，只有發(fā)生甲基化不被切割的DNA才能被PCR擴(kuò)增，檢測有條帶，反之則無條帶。結(jié)果表明，黃鱔性腺、腎、脾、肝、腸等5個組織在不同的光照周期、pH值、溫度下的甲基化狀態(tài)是一致的，DMRT3-FR2擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均是甲基化的；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3擴(kuò)增序列中的位點(diǎn)均是去甲基化的。本研究采用限制性內(nèi)切酶結(jié)合PCR的方

法進(jìn)行甲基化位點(diǎn)研究，具有簡單、快捷的特點(diǎn)。覃揚(yáng)等建立甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶結(jié)合半巢式降落PCR方法，研究P16基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，所采用的HpaⅡ酶切后半巢式PCR方法的特異性強(qiáng)，靈敏度達(dá)100 fg，說明該試驗(yàn)方法簡便、成本低廉，并且有高度的特異性與靈敏度，實(shí)際應(yīng)用價值高[15]。

體細(xì)胞中大多數(shù)常染色體基因的CpG島保持非甲基化狀態(tài)，只有一小部分在正常組織和細(xì)胞中發(fā)生甲基化，表明甲基化位點(diǎn)在生物體內(nèi)存在廣泛，同時對基因的表達(dá)存在著一定的調(diào)節(jié)功能。Navarro-Martin等研究發(fā)現(xiàn)，1齡歐洲鱸魚（Dicentrarchus labrax）的腦組織中，cyp19a啟動子甲基化程度不受性別和溫度的調(diào)控；在性腺中，cyp19a啟動子甲基化程度雄魚是雌魚的2倍，但在高溫下雌魚cyp19a 啟動子甲基化程度有所增加；在腦和性腺中，管家基因β-actin啟動子的甲基化程度也與性別和溫度無明顯關(guān)系[9]。本試驗(yàn)結(jié)果與其相似。歐洲鱸魚的性別受基因型和溫度的雙重控制，由于這種特殊的性控機(jī)制，若在其性腺形成前改變溫度，則可以影響其性別比例。cyp19a基因編碼cyp19a芳香化酶，該酶的活性影響性激素比值。更重要的是在大多數(shù)變溫脊椎動物中，環(huán)境溫度控制性別比例均是通過調(diào)控cyp19a基因的表達(dá)量而實(shí)現(xiàn)的。Varriale等研究對比了南極與熱帶魚類機(jī)體甲基化程度，結(jié)果表明，南極魚類甲基化程度明顯高于熱帶魚類，推測動物機(jī)體甲基化程度與體溫呈負(fù)相關(guān)，但是，他們發(fā)現(xiàn)屬于虎魚科鯖科和麗鯛科的魚類機(jī)體甲基化程度與其體溫呈正相關(guān)，即使是相同體溫的魚類，其機(jī)體甲基化程度也有明顯差異，所以他們認(rèn)為其他因子如水深、產(chǎn)地、馴化時間及新陳代謝率等都會對魚類機(jī)體甲基化程度產(chǎn)生影響[14]。Jabbari 等研究也證明，除了體溫外，存在甲基化的序列數(shù)量和基因片段長度也會影響動物機(jī)體甲基化程度[13]。Varriale等研究結(jié)果表明，熱帶魚類水溫控制范圍為20～30 ℃，極地魚類水溫控制范圍為0～10 ℃，溫差較本試驗(yàn)設(shè)置的溫度梯度（25、28、31 ℃）差異大很多，可能導(dǎo)致結(jié)果[14]不一致。

甲基化作為DNA修飾的重要途徑，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，也成為目前的研究熱點(diǎn)[16]。本試驗(yàn)所用方法可以快速檢測多個基因的啟動子甲基化狀態(tài)，是其他方法無法達(dá)到的。但在試驗(yàn)過程中需要特別注意HpaⅡ酶切時要確保酶切完全，否則殘余的微量未被HpaⅡ切開的未甲基化5′-CCGG-3′ 就可能作為 PCR反應(yīng)的模版導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。為了驗(yàn)證本試驗(yàn)建立的HpaⅡ限制性內(nèi)切酶方法是否具有廣泛的適用性，將進(jìn)一步在更多的其他魚類中進(jìn)行確證應(yīng)用，為該方法的推廣應(yīng)用提供豐富的科學(xué)依據(jù)。

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