3種苯胺類對斑馬魚的急性毒性

裘麗萍++范立民+劉琦++陳家長

摘要：為研究N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性，以斑馬魚（Brachydanio rerio）為試驗(yàn)生物，采用靜態(tài)試驗(yàn)法，參照《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》中有關(guān)急性毒性的方法測定3種藥物對斑馬魚的急性毒性LC50。結(jié)果表明，N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度LC50分別為66.08、146.15、76.82 mg/L，安全質(zhì)量濃度分別為6.61、1461、7.68 mg/L。

關(guān)鍵詞：苯胺類；急性毒性；斑馬魚；安全質(zhì)量濃度

中圖分類號： S941.91文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0325-03

收稿日期：2015-05-05

基金項(xiàng)目：國家水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估項(xiàng)目（編號：GJFP2014009）。

作者簡介：裘麗萍（1977—），女，黑龍江雙鴨山人，助理研究員，主要從事漁業(yè)環(huán)境保護(hù)研究。E-mail：qiulp@ffrc.cn。

通信作者：陳家長，碩士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與保護(hù)、養(yǎng)殖環(huán)境修復(fù)、健康養(yǎng)殖、生態(tài)環(huán)境評價(jià)等研究。E-mail：chenjz@ffrc.cn。魚類是國際上常用于測試化學(xué)品毒性的物種。斑馬魚（Brachydanio rerio）別稱花條魚、藍(lán)條魚、斑馬擔(dān)尼魚，原產(chǎn)于印度、孟加拉國，由于斑馬魚擁有其他模式生物所不具備的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各領(lǐng)域[1-2]。

中國漁業(yè)產(chǎn)量連續(xù)多年居世界首位，但繁榮的同時(shí)卻陷入“漁業(yè)資源嚴(yán)重衰退，生態(tài)債臺高筑”的境地，漁業(yè)生態(tài)資本嚴(yán)重透支，漁業(yè)污染陷入難解的僵局。隨著工業(yè)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，漁業(yè)污染事故的發(fā)生頻率呈上升趨勢，而工業(yè)廢水污染是漁業(yè)水域最嚴(yán)重的污染源[3-6]。目前，漁業(yè)生產(chǎn)中使用的農(nóng)藥等對水生生物的毒性已引起廣大科技工作者重視，并進(jìn)行了很多重要研究[7-9]。然而，可能導(dǎo)致漁業(yè)污染事故的化工產(chǎn)品對水生生物的毒性卻鮮有報(bào)道。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺均是農(nóng)藥、醫(yī)藥、染料重要的中間體，采用這3種化工產(chǎn)品對斑馬魚進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，判斷其對魚類的安全性，以期為苯胺類魚類污染事故的預(yù)防提供數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

N，N-二甲基苯胺（含量>99%）、2，4二甲氧基苯胺（含量>98%）、2-甲氧基-6-甲基苯胺（含量>98%）、助溶劑二甲亞砜（含量>98%）均購自上海市安譜科學(xué)儀器有限公司，由德國CNW科技公司生產(chǎn)。移液槍（Eppendorf公司產(chǎn)品）、METTLER AL204型電子分析天平、5 L玻璃圓形水槽。

1.2試驗(yàn)材料

供試斑馬魚購自無錫市南禪寺花鳥魚市場，平均質(zhì)量為（0.20±0.02） g，平均體長為（2.4±0.2） cm。試驗(yàn)前對斑馬魚進(jìn)行篩選，并在水族箱中馴養(yǎng)10 d以上，自然死亡率低于2%。馴養(yǎng)期間每天定時(shí)投顆粒餌料，試驗(yàn)前1 d開始禁食，選擇活動性強(qiáng)的健康魚作為試驗(yàn)用魚，試驗(yàn)期間不喂食。試驗(yàn)用水為曝氣3 d后除氯的自來水，pH值為7.02～7.06，總硬度為8.10～8.15（德國度），水質(zhì)溶氧量含量保持在5 mg/L以上。水中Zn、Fe含量分別為0.02、0.05 mg/L，Pb、Cu、Cd均未檢出。水質(zhì)化學(xué)需氧量（COD）為2.05～2.25 mg/L，水溫為（27±1）℃。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照國家環(huán)境保護(hù)總局等編著的《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》[10]中有關(guān)急性毒性的方法進(jìn)行測定。通過預(yù)備試驗(yàn)分別獲得N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺致受試魚100%存活的最高質(zhì)量濃度、致受試魚100%死亡的最低質(zhì)量濃度，并在兩者間選擇下一步正式試驗(yàn)的濃度范圍，確定5個試驗(yàn)質(zhì)量濃度組。試驗(yàn)期間不喂食、不充氧。前8 h連續(xù)觀察，記錄魚的反應(yīng)情況并及時(shí)撈出死亡個體；分別于24、48、72、96 h觀察魚的死亡情況并記錄。如果魚的腹部向上，鰓蓋停止運(yùn)動，用玻璃棒或鑷子反復(fù)輕擊魚的尾部均不產(chǎn)生任何應(yīng)激反應(yīng)，即判定死亡。

1.3.1N，N-二甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性向盛有3 L曝氣自來水的圓形玻璃水槽中加入N，N-二甲基苯胺儲備液，使水中N，N-二甲基苯胺的質(zhì)量濃度分別為50、60、65、70、80 mg/L。將水體攪拌均勻，放入10尾健康的受試斑馬魚，進(jìn)行96 h的觀察記錄。每個質(zhì)量濃度設(shè)3個平行組，并設(shè)空白對照組、助溶劑對照組。

1.3.22，4-二甲氧基苯胺對斑馬魚的急性毒性向盛有 3 L 曝氣自來水的圓形玻璃水槽中加入2，4-二甲氧基苯胺儲備液，使水中2，4-二甲氧基苯胺的質(zhì)量濃度分別為120、140、165、170、185 mg/L。將水體攪拌均勻，放入10尾健康的受試斑馬魚，進(jìn)行96 h的觀察記錄。每個質(zhì)量濃度設(shè)3個平行組，并設(shè)空白對照組、助溶劑對照組。

1.3.32-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性向盛有3 L曝氣自來水的圓形玻璃水槽中加入2-甲氧基-6-甲基苯胺儲備液，使水中2-甲氧基-6-甲基苯胺的質(zhì)量濃度分別為60、70、80、85、90 mg/L。將水體攪拌均勻，放入10尾健康的受試斑馬魚，進(jìn)行96 h的觀察記錄。每個質(zhì)量濃度設(shè)3個平行組，并設(shè)空白對照組、助溶劑對照組。

1.4結(jié)果分析

根據(jù)各組試驗(yàn)魚在24、48、72、96 h的死亡數(shù)計(jì)算平均死亡率，再轉(zhuǎn)化為概率單位，計(jì)算出試驗(yàn)液質(zhì)量濃度的對數(shù)。采用直線回歸法求出概率單位數(shù)與試驗(yàn)液質(zhì)量濃度對數(shù)的回歸方程，根據(jù)方程分別求出N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺在24、48、72、96 h對魚類的半致死質(zhì)量濃度LC50和安全質(zhì)量濃度[10]。

2結(jié)果與分析

2.1N，N-二甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

在N，N-二甲基苯胺對斑馬魚的96 h急性毒性試驗(yàn)期間，空白對照組、助溶劑對照組的受試斑馬魚全部存活，活動正常；50 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)35 h后開始死亡，96 h死亡率為20%；60 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn) 30 h 后開始死亡，48 h死亡率為20%，96 h死亡率為30%；65 mg/L 質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)18 h后開始死亡，96 h死亡率為40%；70 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)10 h后開始死亡，96 h死亡率為60%；80 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)3 h后開始死亡，96 h死亡率為80%（表1）。由表1還可知，N，N-二甲基苯胺對斑馬魚24、48、72、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度LC50分別為83.90、77.50、73.10、66.08 mg/L，安全質(zhì)量濃度為6.61 mg/L。

2.22，4-二甲氧基苯胺對斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

在2，4-二甲氧基苯胺對斑馬魚的96 h急性毒性試驗(yàn)期間，空白對照組、助溶劑對照組的受試斑馬魚全部存活，活動正常；120 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)40 h后開始死亡，96 h死亡率為20%；140 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)30 h后開始死亡，48 h死亡率為20%，96 h死亡率為30%；165 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)20 h后開始死亡，96 h死亡率為60%；170 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)8 h后開始死亡，96 h死亡率為90%；185 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)2 h后開始死亡，96 h死亡率為100%（表2）。由表2還可知，2，4-二甲氧基苯胺對斑馬魚24、48、72、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度LC50分別為161.70、165.04、15865、146.15 mg/L，安全質(zhì)量濃度為14.61 mg/L。

2.32-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

在2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚的96 h急性毒性試驗(yàn)期間，空白對照組、助溶劑對照組的受試斑馬魚全部存活，活動正常；60 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)80 h后開始死亡，96 h死亡率為10%；70 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)40 h后開始死亡，48 h死亡率為10%，96 h死亡率為20%；80 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)20 h后開始死亡，96 h死亡率為40%；85 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn) 13 h 后開始死亡，96 h死亡率為80%；90 mg/L質(zhì)量濃度組的受試魚在試驗(yàn)7 h后開始死亡，96 h死亡率為90%（表3）。由表3還可知，2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚24、48、72、96 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度LC50分別為91.77、88.96、8420、76.82 mg/L，安全質(zhì)量濃度為7.68 mg/L。

隨著時(shí)間的延長，各質(zhì)量濃度組受試魚的死亡率均呈增加趨勢；在同一時(shí)間下，高質(zhì)量濃度組受試魚的死亡率明顯高于低質(zhì)量濃度組?？梢姡茉囁幬飳Π唏R魚的毒性作用隨藥物暴露時(shí)間的延長及暴露質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。

3討論

3.13種苯胺類藥物對斑馬魚的急性毒性級別判定

本研究使用的3種苯胺類藥物的24～96 h半致死質(zhì)量濃度依次降低，表明3種苯胺類藥物對魚的毒性均隨藥物暴露時(shí)間的延長而增強(qiáng)。以96 h半致死質(zhì)量濃度為評判對象，由魚類急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[10]可知，N，N-二甲基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺均屬于中毒物質(zhì)，2，4-二甲氧基苯胺屬于低毒物質(zhì)。

3.23種苯胺類藥物對斑馬魚的毒性評價(jià)

由表4可知，在96 h試驗(yàn)期間，N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚表現(xiàn)出的毒性癥狀及毒性規(guī)律相似，96 h的LC50與安全質(zhì)量濃度接近?？梢?，苯胺類化合物在苯環(huán)或氨基上引入甲基或甲氧基對其毒性影響不大，處理這類物質(zhì)的漁業(yè)污染事故時(shí)可參考相似結(jié)構(gòu)的化合物。

硝基苯等國內(nèi)常用化工產(chǎn)品均會對受試魚類產(chǎn)生遺傳毒性[11]及對抗氧化應(yīng)激酶（過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等）[12]造成影響，甚至具有強(qiáng)烈的致癌、致畸、致突變作用[13]。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺是農(nóng)藥、醫(yī)藥、染料重要的中間體，在農(nóng)藥、醫(yī)藥、燃料的使用和生產(chǎn)過程中進(jìn)入水體，可能殘留于水體中的魚類體內(nèi)，進(jìn)而危害機(jī)體。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺長期暴露對魚類是否產(chǎn)生毒害，及其分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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