TSP—1甘薯濃縮口服液的安全性評價(jià)

王洪云++張毅++鈕福祥++徐飛++孫健++岳瑞雪++朱紅

摘要：為評價(jià)TSP-1甘薯口服液的安全性，開展受試小鼠急性毒性試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子致畸試驗(yàn)以及血清生化指標(biāo)試驗(yàn)等，結(jié)果表明，TSP-1甘薯口服液灌胃小鼠的最大耐受劑量達(dá)到60 g/kg（人體推薦用量的120倍）時(shí)，小鼠的主要臟器均無可見病變出現(xiàn)；對小鼠骨髓細(xì)胞微核率無影響，無致突變作用；未引發(fā)小鼠精子畸形，無遺傳毒性。TSP-1甘薯口服液連續(xù)灌胃35 d后，小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性有所增強(qiáng)，表明其對肝臟可能有一定影響，但中、低劑量組均未達(dá)到顯著水平；高、中劑量組血清乳酸脫氫酶（LDH）活性顯著減弱，低劑量組與對照沒有顯著影響。血清生化檢測結(jié)果表明，TSP-1甘薯口服液對肌酐含量、尿酸含量、肌酸激酶活性均無顯著影響，說明它對腎和心肌無毒性。

關(guān)鍵詞：甘薯；濃縮口服液；安全性評價(jià)

中圖分類號： TS275.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0396-03

收稿日期：2015-05-13

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-11-B-20）。

作者簡介：王洪云（1964—），女，江蘇徐州人，主治醫(yī)師、助理研究員，從事甘薯功能食品研究。 E-mail：xzwanghy@163.com。

通信作者：鈕福祥，研究員，從事甘薯產(chǎn)后加工。E-mail：niufuxiang@sina.com。甘薯（Ipomea batatas ）是一種藥食同源作物，具有重要的藥用保健價(jià)值[1-2] 。研究表明，特種甘薯TSP-1具有降低大鼠血液總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（AI）及增加血小板等功能；還對脾氣虛癥、脾不統(tǒng)血癥以及抗栓和提高免疫力等具有良好的效果[3-4]。近20年來，筆者通過TSP-1甘薯對志愿者的臨床試用效果進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)該品種的葉子提取加工物對原發(fā)性和繼發(fā)性過敏性紫癜具有明顯治療作用。但迄今為止，有關(guān)甘薯加工產(chǎn)品的安全性研究卻鮮見報(bào)道，因此本研究以TSP-1甘薯濃縮口服液為材料，按照相關(guān)規(guī)范[5-6]，對受試小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子致畸試驗(yàn)，并測定相關(guān)血清生化指標(biāo)等，旨在為TSP-1甘薯功能食品的研究和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1受試動(dòng)物

ICR小鼠，清潔級，18～22 g，85只雄性，35只雌性，共120只，均購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2TSP-1甘薯濃縮口服液

TSP-1甘薯濃縮口服液，由江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所）提供，批號為20150105，4 ℃ 保存，使用前搖勻。加工流程為：TSP-1甘薯原料→前處理（清洗、去沙、粉碎等）→加水負(fù)壓煮沸浸提→過濾→真空濃縮→配料→灌裝→封口→殺菌→冷卻→檢驗(yàn)→成品。

1.3主要儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific Inc，D37520）、生物顯微鏡（日本OLYMPUS，BX51TRF）、酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific Inc，3001-1227）、灌胃針、解剖器械、培養(yǎng)箱、冰箱等。

1.4主要試劑

新生牛血清（浙江省杭州四季青生物工程材料有限公司）、快速姬姆薩染液、伊紅染液、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT）測試盒、天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草轉(zhuǎn)氨酶GOT）測試盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、肌酐（Cr）測定試劑盒、肌酸激酶（CK）測定試劑盒、尿酸（UA）測試盒（南京建成科技有限公司）、 Giemsa應(yīng)用液、注射用環(huán)磷酰胺（含安道生0.2 g）（美國百特國際有限公司）。

1.5方法

1.5.1急性毒性試驗(yàn)

1.5.1.1劑量設(shè)置依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》第二部分毒理學(xué)檢驗(yàn)方法第一章急性毒性試驗(yàn)的設(shè)置原則，即高劑量組為最大使用濃度和灌胃劑量[5]。

1.5.1.2預(yù)試驗(yàn)采用24 h內(nèi)最大給藥量法，試驗(yàn)小鼠在1 周內(nèi)未見明顯異常或死亡，說明該受試物毒性較低，可能無法測出其LD50值，所以進(jìn)行最大耐受量試驗(yàn)[7-8]。

1.5.1.3最大耐受量試驗(yàn)采用最大使用濃度和最大灌胃劑量給予20只動(dòng)物后，連續(xù)觀察14 d，未見任何動(dòng)物死亡時(shí)的給藥量。20只小鼠，雌雄各半，常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)1周后24 h內(nèi)灌胃給藥3次，總給藥量為60 g/kg（為人體推薦用量的120倍）。給藥結(jié)束后觀察14 d，逐日記錄動(dòng)物的毒性反應(yīng)和死亡情況，最后一天脫頸椎處死小鼠并解剖，肉眼觀察腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等主要臟器病理改變。

1.5.2骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

1.5.2.1劑量設(shè)置及分組依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》第二部分毒理學(xué)檢驗(yàn)方法第三章骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的設(shè)置原則[5]，即高劑量組按照10 g/kg以上，或人體推薦攝入量的100倍以上，或一次最大灌胃劑量進(jìn)行設(shè)計(jì)，本試驗(yàn)中TSP-1甘薯口服液設(shè)共設(shè)高、中、低3個(gè)劑量組，給藥量分別為60、30、15 g/kg，另設(shè)陰性對照組（生理鹽水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg）。

1.5.2.2給藥與樣本制備50只小鼠，雌雄各半，常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)1周，然后分2次給藥，間隔時(shí)間為24 h，第2次給藥6 h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下兩側(cè)股骨，用注射器吸取1 mL小牛血清將骨髓沖出，移液槍吹打使其均勻，以1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入0.2 mL小牛血清與沉淀物混勻后，取2 μL滴在清潔的載玻片上，推片，涂片，寫好標(biāo)簽，自然晾干后放入甲醇溶液中固定15 min，晾干后滴加新鮮配制的Giemsa應(yīng)用液染色10 min，流水沖洗掉載玻片上的染色液，置晾片架上晾干。

1.5.2.3觀察計(jì)數(shù)在低倍鏡下觀察，選擇分布均勻、染色較好的區(qū)域，100×油鏡下觀察計(jì)數(shù)。嗜多染紅細(xì)胞（PCE）通常為灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞（RBC）呈粉紅色。微核多呈圓形，邊緣光滑整齊，染色與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。計(jì)數(shù) 1 000 個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)量（嗜多染紅細(xì)胞中出現(xiàn)2個(gè)或更多個(gè)微核，仍按1個(gè)微核細(xì)胞計(jì)算），并且計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE與RBC的比值。正常的PCE/RBC比值約為1，如比值<0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制；如比值 <005，則表示受試化學(xué)毒物的劑量過大，試驗(yàn)結(jié)果不可靠。

1.5.3精子畸形試驗(yàn)

1.5.3.1劑量設(shè)置依據(jù)及分組依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》第二部分毒理學(xué)檢驗(yàn)方法第五章小鼠精子畸形試驗(yàn)的設(shè)置原則[5]，試驗(yàn)共分5個(gè)組（同“1.5.2.1”節(jié)）。

1.5.3.2給藥與標(biāo)本制備50只雄性小鼠，常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)1周后連續(xù)灌胃35 d。試驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取出兩側(cè)附睪，放入生理鹽水中，將附睪縱向剪1～2刀，放置于 37 ℃ 孵箱10 min。將大塊組織棄去，以1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入0.2 mL生理鹽水與沉淀物混勻后，取2 μL滴在清潔載玻片上，推片。涂片寫好標(biāo)簽，自然干燥后放入甲醇溶液中固定15 min，取出晾干，滴加新鮮配制的1%伊紅染色1 h，流水沖洗掉載玻片上的染色液，置晾片架上晾干。

1.5.3.3觀察計(jì)數(shù)在5×倍鏡下找到背景清晰、精子重疊較少的部位，用40×倍鏡觀察計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)完整的精子。精子有頭無尾（輪廓不清）或頭部與其他精子或碎片重疊，或明顯是人為剪碎者，均不計(jì)算，每只小鼠檢查1 000個(gè)精子。精子畸形，主要表現(xiàn)為頭部，其次為尾部?；晤愋涂煞譃闊o鉤、香蕉形、無定形、尾折疊、雙頭雙尾、胖頭等。

1.5.4血清生化檢測在連續(xù)灌胃35 d后（見“1.5.3.2”節(jié)），小鼠摘眼球取血清，分裝保存在-20 ℃冰箱以備后續(xù)檢測。按照Liu等的方法測定谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酐（CRE）、尿酸（UA）以及肌酸激酶（CK）的活性[9-10]。

2結(jié)果與分析

2.1急性毒性

給藥后當(dāng)天，小鼠毛色光澤，對外反應(yīng)和活動(dòng)正常，但飲水、采食減少，糞便呈深褐色或黑色，略不成形，尿液正常。給藥后連續(xù)觀察14 d，小鼠存活狀況良好，毛色均較為光澤，活動(dòng)、飲水、采食以及對外反應(yīng)均正常，尿液、糞便無異常。給藥2周內(nèi)雄鼠和雌鼠的體質(zhì)量均明顯增加（表1），未見異?；蛩劳鲂∈?。解剖結(jié)果顯示腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等主要臟器無肉眼可見病理改變。由于給藥量已達(dá)到60 g/kg，是人推薦用量的120倍，因此小鼠灌服TSP-1甘薯濃縮口服液無毒性反應(yīng)。

2.2骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

各組PCE與RBC的比值均處于0.89～1.2的正常范圍內(nèi)，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠。TSP-1甘薯口服液3個(gè)劑量組微核數(shù)、微核率均與生理鹽水對照組相近，沒有顯著差異，而陽性對照環(huán)磷酰胺組小鼠骨髓微核率極顯著高于對照組（P<0.01），表明TSP-1甘薯口服液對小鼠染色體完整性與染色體分離無影響（表2）。

2.3精子畸形試驗(yàn)

試驗(yàn)期間各組小鼠進(jìn)食情況良好，活動(dòng)未見異常，體質(zhì)量增加正常。根據(jù)小鼠正常精子與畸形精子的對比與計(jì)數(shù)（圖1），TSP-1甘薯口服液3個(gè)劑量組精子畸形數(shù)、畸形率均與陰性對照組（生理鹽水）相近，相互之間均沒有顯著差異，而陽性對照環(huán)磷酰胺組小鼠精子畸形數(shù)、畸形率極顯著高于生理鹽水對照組（P<0.01），表明TSP-1甘薯口服液對小鼠生殖細(xì)胞的形成無影響（表3）。

2.4血清生化指標(biāo)影響

血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，TSP-1甘薯口服液3個(gè)劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活力均高于陰性對照組，其中高劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶活力與對照組之間差異顯著（P<0.05），其余組與對照之間差異不顯著，說明TSP-1

甘薯口服液除最高劑量組有一定影響外，其余組對肝臟均沒有顯著影響；但3個(gè)劑量組乳酸脫氫酶（LDH）活力均低于對照組，其中高、中劑量組與對照之間有顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）差異。3個(gè)劑量組肌酐、尿酸含量以及肌酸激酶活力與陰性對照組相近，沒有顯著差異，表明TSP-1甘薯口服液無腎毒性和心肌毒性（表4）。

3結(jié)論與討論

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)TSP-1甘薯口服液灌胃小鼠的最大耐受劑量達(dá)到60 g/kg（人體推薦用量的120倍）時(shí)，小鼠的主要臟器均無可見病變出現(xiàn)；骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)證明它無致突變作用；精子致畸試驗(yàn)結(jié)果顯示它不會(huì)引發(fā)小鼠精子畸形，無遺傳毒性。血清生化試驗(yàn)結(jié)果表明，TSP-1甘薯口服液連續(xù)灌胃35 d后，小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶有所升高，但除了高劑量組的谷草轉(zhuǎn)氨酶達(dá)到顯著水平外，其余組與對照均無顯著差異，表明中、低劑量TSP-1甘薯口服液對肝臟均沒有顯著影響；高、中劑量組乳酸脫氫酶水平顯著下降，低劑量組與對照沒有顯著差異，表明60倍以上TSP-1甘薯口服液用量可能會(huì)對腎臟有一定的影響；但各劑量組TSP-1甘薯口服液對肌酐、尿酸、肌酸激酶水平無顯著影響，表明它對腎和心肌無毒性。

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是醫(yī)學(xué)臨床上肝功能檢查的主要指標(biāo)之一[9]，本試驗(yàn)高劑量組谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測值顯著高于陰性對照，說明當(dāng)用量達(dá)到推薦量的120倍時(shí)對肝臟產(chǎn)生一定的影響，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究，但在60倍以下用量時(shí)均屬于安全。乳酸脫氫酶廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞的可溶性部分中[10]，它是檢查腎功能的主要指標(biāo)之一[11]，乳酸脫氫酶偏低通常由內(nèi)分泌失調(diào)、過于勞累、睡眠不好、心情不好等引起，一般經(jīng)過調(diào)理即可恢復(fù)，但如果乳酸脫氫酶明顯偏高則要引起重視了，臨床證明凡患有肝炎、 心肌梗塞癥、肺梗塞癥、充血性心力衰竭及某些惡性腫瘤等，此酶活性水平較正常值高6～10倍[10]。本研究結(jié)果表明，TSP-1甘薯口服液各劑量組均未使小鼠血清乳酸脫氫酶值升高，相反，高、中劑量組乳酸脫氫酶指標(biāo)顯著偏低，具體如何影響及其機(jī)理也有待研究，但通過肌酐、尿酸、肌酸激酶的檢測結(jié)果證明，它對腎和心肌并無毒性。綜上所述，TSP-1甘薯口服液除用量達(dá)到正常劑量120倍時(shí)對肝、60倍時(shí)對腎可能有一定影響外，其余情況下對主要臟器均無毒無害，是安全的，考慮到正常情況下使用量不可能到達(dá)推薦量的120倍或60倍，因此TSP-1甘薯口服液的安全性是可靠的。

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