郭錚蕾，谷 強，韓 玥，徐 姍，李 偉（北京出入境檢驗檢疫局，北京 10026）

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質量控制圖在藍舌病競爭ELISA檢測中的應用

郭錚蕾，谷 強，韓 玥，徐 姍，李 偉
（北京出入境檢驗檢疫局，北京 10026）

摘 要：［目的］建立藍舌病競爭ELISA檢測的質量控制圖。［方法］采用即刻法與Levey-Jennings 常規(guī)質控圖法結合，繪制連續(xù)20次檢測結果的質控圖。更換質控血清批號和試劑盒批號時，采用雙質控法對前3次實驗結果做質控，再轉入常規(guī)質控圖。 ［結果］用即刻法對質控物進行3次連續(xù)測定后，就可對第3次檢測結果進行質量控制，用此方法積累20次質控物的檢測結果后，可用Excel繪制出Levey-Jennings 常規(guī)質控圖，用以實驗室日常質控。若實驗室更換質控血清批號和試劑盒批號，采用雙質控法對前3次實驗結果做質控。［結論］采用雙質控法對前3次實驗結果做質控，改進了即刻法只能從第3次結果進行質控的缺點，加強了即刻法在ELISA檢測中的質控作用。

關鍵詞：質量控制圖；即刻法；雙質控；ELISA；藍舌病

控制圖是對檢測過程中質量的特征值進行測定、記錄、評估，從而觀察檢測過程是否處于控制狀態(tài)的、采用統(tǒng)計方法設計的圖。實驗室使用控制圖是為了預防不符合工作的發(fā)生，這是實驗室內部質量控制的重要方法。CNAS- CL52：2014 《CNAS-CL01＜檢測和校準實驗室能力認可準則＞應用要求》［1］5.9.2規(guī)定，“適用時，實驗室應使用質量控制圖來監(jiān)控檢測或校準結果的準確性和精密度”。質量控制圖多用于實驗室定量分析的質量控制，在免疫學方面多應用于醫(yī)學實驗室，但應用于動檢領域的ELISA方法未見報道。

與一般定量分析的質控方法相比，ELISA檢測的室內質控有其特殊性。ELLSA檢測試劑盒的有效期短，批號更換較頻繁，因此實驗室在短期內很難積累20次質控物的檢測結果，所以對同一批號試劑在常規(guī)條件下連續(xù)檢測20次，難度大，易造成數(shù)據(jù)不足，難以做出完整的質控圖，進而不能即時進行試驗監(jiān)控，失去了質控意義。

目前，對ELISA試驗的實驗室內質控，常規(guī)上采用即刻法（Grubbs 法）和Levey-Jennings 常規(guī)質控圖（簡稱L-J圖）結合的方法［2-3］。用即刻法連續(xù)測量3次就可對第3次結果進行質控，彌補了L-J圖需要連續(xù)測定20次才能進行質控的局限，但是使用即刻法無法判斷前2次的檢測結果是否在控，而采用雙質控法［4-5］對前3次試驗結果進行質控，再按即刻法處理，即可達到控制的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與 試劑

酶標儀（Multiskan FC）、洗板機（Wellwash Versa ）、藍舌病競爭試劑盒（IDVET，批號656、680）。

1.2 即刻法繪制質控圖

按ELISA試劑盒說明書操作，以450 nm波長比色，按說明書計算臨界值（cut-off值，CO），每個板測兩個陰性對照，CO=OD陰*0.4，每個板測兩個陽性對照，S=OD陽，用S/CO值表示質控值，從第3次測量開始用“即刻法”對結果進行質控，計算3次S/CO值的均值（）和標準差（s），再計算SI上限和SI下限，查SI值表判斷質控結果有無失控［6］，按照Grubbs剔除異常值的方法［6］，若結果處于“告警”或“失控”狀態(tài)應舍去，并重新測定質控血清；若結果處于控制范圍內，繼續(xù)檢測并計算，積累20次測定結果后，用Excel畫出L-J質控圖。具體做法是：

在Excel中輸入20次測量的OD陽、OD陰，用AVERAGE函數(shù)公式計算D陽、D陰，編輯函數(shù)公式，計算CO值和S/CO值。從第3次的測量結果開始，用AVERAGE函數(shù)計算S/CO的平均值（），用SDTV函數(shù)計算標準差（s）。從第3次的測量結果開始，用MAX函數(shù)和MIN函數(shù)分別計算最大值和最小值。編輯函數(shù)（xmax-）/s計算SI上限，編輯函數(shù)（-xmin）/s計算SI下限。根據(jù)SI值表，用IF函數(shù)編輯上限結果和下限結果的在控狀態(tài)，當SI上限和SI下限均小于n2s時，表示結果“在控”；當SI上限或SI下限處于n2s和n3s之間時，表示結果“告警”；當SI上限或SI下限大于n3s時，表示結果“失控”。處于“告警”和“失控”狀態(tài)的數(shù)值應舍去。

以測量次數(shù)作為橫坐標、以S/CO值作為縱坐標，用Excel繪制L-J常規(guī)質控圖，系列分別選擇“質控數(shù)據(jù)（S/CO）” “上控制限UCL（+3s）” “UWL上警戒限（+2s）” “中心線CL（）” “下警戒限LWL （-2s）” “LCL下控制限（-3s）”。設置縱坐標的最大值為+4s、最小值為—x-4s、主要刻度單位為s值、次要刻度單位為s/10的值。

表1 SI值表

1.3 雙質控法繪制質控圖

在更換質控血清批號時，將新批號的質控血清在舊批號質控血清即將結束使用時與舊批號質控血清一起測定3次，也就是在同一酶標板上分別加新、舊批號的質控血清。舊批號質控血清數(shù)據(jù)點進上一質控圖計算，新批號血清的質控結果按即刻法分析。在更換試劑盒批號時，在舊批號的試劑盒即將結束使用時將新批號試劑盒的部分孔位與舊批號試劑盒同時測定3 次，兩種試劑盒均加入同一批號的質控血清，舊批號試劑盒的質控結果點進質控圖，新批號血清的質控結果按即刻法分析。

2 結果

2.1 即刻法繪制質控圖

從表2中看出，第4次和第5次數(shù)據(jù)出現(xiàn)了“失控”的情況。按照Grubbs法剔除異常值，將第4次的測量結果剔除掉后，以下的測量結果均在控。剔除異常值后的測量結果見表3，畫L-J質控圖，如圖1所示。

表2 即刻法所得20次測量結果及數(shù)值在控狀態(tài)

根據(jù)控制圖的判斷原則［7］，未出現(xiàn)判穩(wěn)準則和判異準則中的以下異常情況：21個點中有1點落在3s以外；連續(xù)9點落在中心線同一側；連續(xù)6點遞增或遞減；連續(xù)14點中的相鄰點交替上下；連續(xù)3點中的2點落在中心線同一側2s以外；連續(xù)5點中的4點落在中心線同一側1s以外；連續(xù)15點落在中心線兩側的1s以內；連續(xù)8點落在中心線兩側，且無一在1s以內。因此，本批次20次質控值建立起的質控圖是有效的。

2.2 雙質控法繪制質控圖

2.2.1 兩種批號質控血清雙質控法的結果見表3，舊批號40～42 次的質控血清與新批號1～3 次的質控血清對應同板試驗。

2.2.2 兩種批號試劑盒雙質控法結果見表4，舊批號試劑盒31～33次與新批號試劑盒1～3 次對應同批質控血清試驗。

表3 Grubbs法剔除異常值后的20次測量結果

3 討論

在檢測工作中進行實驗室內部質量控制是降低實驗誤差、保證檢測質量的重要手段。對于定量檢測項目，大多采用Levey-Jenings質控方法或Westgard多規(guī)則質控方法繪制質控圖。免疫學很多檢測項目采用ELISA法定性，但因手工法和半自動化等特點導致其難以標準化，且檢測頻次低、試劑盒有效期短、批號更換頻繁，因此ELISA試驗的質控圖多采用即刻法與常規(guī)質控圖結合的方法。

圖1 藍舌病競爭ELISA質控圖

圖2 藍舌病競爭ELISA舊批次質控血清24～42次質控數(shù)據(jù)質控圖

表4 不同批次質控血清質控數(shù)據(jù)

表5 不同批次試劑盒質控數(shù)據(jù)

圖3 藍舌病競爭ELISA舊批次試劑盒15～33次質控數(shù)據(jù)質控圖

不同于定量檢測項目選取被測性能在重復試驗中相對穩(wěn)定的值作為特征值，免疫學試驗中臨界于cut-off值（CO值）的低值弱陽性質控物是質控的關鍵，低值弱陽性-臨界值血清是質控精密度觀測的最敏感的窗口，也是提示試驗是否成功的標識，因此選擇S/CO值作為質控的特征值。

Grubbs法是一種離群值檢驗的統(tǒng)計方法，一組測定值中的明顯偏離測定值群體的過大或過小值稱為離群值，其既可能是測定結果隨機波動的極值，也可能是與群體測定值非屬同質總體的異常值。如果事先給定一個小概率事件臨界點作為隨機因素影響的最大波動值（即SI界值表），那么凡是測定偏差超過臨界值的離群值將被視為異常值，反之被視為極值加以保留。使用即刻法在出現(xiàn)“告警”或“失控”值時，對于結果的取舍有兩種意見，一是出現(xiàn)“告警”或“失控”值時，剔除末次測定值；二是出現(xiàn)“告警”或“失控”值時，剔除最大偏離值。Grubbs法用公式SI上限=（Xmax-）/s，SI下限=（-Xmin）/s計算SI上限和SI下限值，然后與臨界值表（即SI值表）進行比較，以判斷臨界值是否為異常值，因此Grubbs法是判斷一組測定值中的極大或極小值是“在控極值”還是“異常值”的方法，不能用末次測定值作為異常值。

在表2中，從第4次測定結果開始，連續(xù)出現(xiàn)了2個“失控” 值，由于第4次的測量結果與前3次比是最大值，第4次極值引發(fā)了第5次測量值的失控，因此剔除了第4次極大值后，以下結果均變?yōu)椤霸诳亍薄?/p>

由于即刻法是從當天和以前的所有測定值中找出最大值和最小值，因此在測定次數(shù)較少時，用即刻法有些離群值不一定會顯示失控，但隨著測定次數(shù)的增加，測定值逐漸趨于穩(wěn)定，這時之前的離群值就會暴露顯示為“告警”或“失控”，因此Grubbs法判斷異常值有一定的滯后性，也被稱為“回顧性失控檢出”。即刻法的另一個缺點是結果容易受到前3個測定值的影響，因為在統(tǒng)計學中，樣本量少時易出現(xiàn)抽樣誤差。因此會出現(xiàn)即刻法未檢出失控值，但是用L-J質控圖分析時發(fā)生失控的現(xiàn)象，這是由于前3次質控結果精密度差引起的。因此在質控數(shù)據(jù)較多的情況下，L-J質控圖法優(yōu)于即刻法，所以在20次測定結果完成后，應及時制作L-J質控圖進行分析。

由于即刻法是從第3次測定才開始進行質控，雙質控法就解決了前2次結果無法進行質控的問題。從表4、表5和圖2、圖3中可以看出，原試劑盒和原血清均處于“在控”狀態(tài)，這也就說明所換試劑盒和質控血清的前3次結果也處于“在控”狀態(tài)，保證了即刻法的所有結果處于連續(xù)可靠狀態(tài)。在免疫學檢測中，不同批號試劑盒，甚至同一批號試劑盒的不同板次所檢測的樣品或質控血清的OD值都會有一定的差異，不同批次質控血清的試驗結果也不一定一樣，在更換試劑盒或質控血清時，試驗結果常處于不穩(wěn)定狀態(tài)，且ELISA 試驗的影響因素較多，因此更需要建立有效的質控分析。此前，ELISA試驗質控圖多用在醫(yī)學檢驗上，如HBsAg的初篩、抗HIV的初篩等，在動物檢疫領域中尚未見報道。本研究將ELISA試驗質控圖初試于動檢領域的藍舌病毒檢測上，為動檢領域其它疫病的ELISA檢測提供了質控方法的參考。但是，目前還沒有ELISA檢測的確切質控方法，因此以藍舌病為初探的質控圖方法有待于在動檢領域的進一步驗證和擴展。

參考文獻：

［1］中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL 52：2014 CNAS-CL01《檢測和校準實驗室能力認可準則》應用要求［Z］.北京：2014.

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［6］中國國家標準化管理委員會. 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和解釋正態(tài)樣本離群值的判斷和處理：GB/T 4843-2008［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［7］國家質量技術監(jiān)督局.常規(guī)控制圖：GB/T4091-2001［S］.北京：中國標準出版社，2001.

（責任編輯：朱迪國）

Application of Quality Control Chart for Detection of Bluetongue Disease Virus by Competitive ELISA

Guo Zhenglei，Gu Qiang，Han Yue，Xu Shan，Li Wei
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026 ）

Abstract ：［Objective］ To establish the quality control chart for detecting bluetongue virus by competitive ELISA.［Methods］The instant method with Levey-Jennings routine quality control chart method was applied to draw an instant-added L-J quality control chart after 20 results were accumulated.While making changes of agent batch number or quality control serum，the double quality control method was used to control the fi rst three detection results and then the routine quality control chart method was used to control the subsequent results.［Results］The three primary quality control data were calculated statistically by instant method.The instant-added L-J quality control chart could be drawn by Excel software after 20 datas were accumulated.While making changes of agent batch number or quality control serum，the double quality control method was used to control the fi rst three results.［Conclusion］The double quality control method solved the problem of uncontrolled test results in the initial times with the instant method and strengthened the quality control with the instant method in ELISA test.

Key words：quality control chart；instant method；double quality control；ELISA；bluetongue

中圖分類號：S851.3

文獻標識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）02-0077-05

基金項目：質檢總局科技計劃項目（2015IK009）——質量控制圖在動檢血清學檢測應用的示范性研究