葉 鋒，馬曉菁，李 靜，易新萍，谷文喜，鐘 旗（.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊，830000；.新疆兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊，830000）

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布魯氏菌病診斷方法的比較分析及細(xì)菌的分離鑒定

葉 鋒1，馬曉菁1，李 靜2，易新萍1，谷文喜1，鐘 旗1
（1.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊，830000；2.新疆兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊，830000）

摘 要：采集疑似布魯氏菌病感染的牛奶和血清各82份，應(yīng)用哈薩克斯坦共和國的布魯氏菌病診斷復(fù)合抗原和國產(chǎn)抗原，分別對血清和奶樣進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和乳環(huán)凝集試驗(yàn)（MRT），用西班牙IELISA奶樣檢測試劑盒對奶樣進(jìn)行檢測，并對所有陽性奶樣進(jìn)行細(xì)菌分離與PCR鑒定。結(jié)果顯示，國產(chǎn)抗原和復(fù)合抗原的RBT結(jié)果與奶樣IELISA總體符合率分別為65.85%和92.68%，SAT結(jié)果與奶樣IELISA總體符合率分別為79.52%和90.24%，MRT結(jié)果與奶樣IELISA總體符合率分別為79.27%和80.49%。PCR和AMOS-PCR檢測結(jié)果顯示分離菌株為羊種布魯氏菌。結(jié)果表明，兩種MRT抗原在血清和奶樣檢測中都存在漏檢現(xiàn)象；從牛乳中分離到布魯氏菌羊種3型，說明出現(xiàn)了跨種傳播，應(yīng)引起重視。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌病；診斷方法；比較；分離鑒定

布魯氏菌?。ê喎Q布?。┦且环N人獸共患傳染性疾病，其分布廣泛，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生事業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展，是國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）中優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的二類動物疫病。近年來，新疆地區(qū)家畜布病與人間布病暴發(fā)頻繁，這給畜牧業(yè)帶來巨大損失，給人民健康帶來了較大威脅，而控制及消除布病的前提是能夠?qū)Σ疾∵M(jìn)行準(zhǔn)確診斷［1］。

大多數(shù)人或動物感染布病后沒有明顯的臨床表現(xiàn)，很難通過流行病學(xué)和臨床癥狀進(jìn)行確診，而布魯氏菌的分離鑒定不但需要的時(shí)間長，而且受采樣時(shí)機(jī)等因素的影響很大，病菌檢出率低，不利于布病的控制［2］。目前對于布病的診斷多采用血清學(xué)及病原學(xué)檢測方法。本病的血清學(xué)診斷方法種類較多，主要檢測血清或乳中的抗體。本研究應(yīng)用哈薩克斯坦共和國布病診斷復(fù)合抗原、國產(chǎn)布病抗原、西班牙IELISA奶樣試劑盒對血清和對應(yīng)乳樣進(jìn)行RBT、SAT、IELISA及乳環(huán)凝集實(shí)驗(yàn)（MRT）比對分析，分離細(xì)菌并鑒定，為布病的診斷提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。采集疑似布病牛血清82份、對應(yīng)奶樣82份。

1.1.2 試劑。RBT抗原和SAT抗原分別使用國內(nèi)A廠家和哈薩克斯坦國家獸醫(yī)研究所的動物布病復(fù)合抗原（以下簡稱復(fù)合抗原）；MRT抗原使用復(fù)合抗原；IELISA布病奶樣檢測試劑盒購自西班牙IDEXX公司；布魯氏菌培養(yǎng)基（Brucella Broth）購自美國BD公司；改良Brucella選擇添加劑（OXOID Ltd）、PCR mix購自北京莊盟生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成于上?；瞪锛夹g(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RBT和SAT。分別取國產(chǎn)抗原30 μL、復(fù)合抗原30 μL與血清30 μL混勻后，5 min內(nèi)觀察結(jié)果；血清稀釋度從1∶25開始倍比稀釋至

1∶200，分別加入10倍稀釋的復(fù)合抗原和國產(chǎn)SAT抗原；復(fù)合抗原組37℃放置溫箱2 h后觀察結(jié)果，國產(chǎn)抗原組37℃溫箱放置過夜觀察結(jié)果；RBT和SAT實(shí)驗(yàn)分別設(shè)立陰陽性對照。

1.2.2 MRT。取凍融搖勻后奶樣2 mL分別加入100 μL復(fù)合抗原和國產(chǎn)抗原，混勻后37℃溫箱放置1 h后觀察結(jié)果。

1.2.3 奶樣IELISA檢測。將奶樣搖勻后每個檢測孔加入100 μL，其余按試劑盒操作步驟執(zhí)行。

1.2.4 奶樣分菌［3］。將凍融的奶樣搖勻后，吸取300 μL接種于含Brucella添加劑的布魯氏菌培養(yǎng)基上，在5%CO2環(huán)境下37℃培養(yǎng)，4 d后觀察菌落形態(tài)。

1.2.5 布魯氏菌屬的PCR鑒定［4］。挑取培養(yǎng)的疑似布魯氏菌菌落置于含200 μL的TS液體培養(yǎng)基中，37℃孵育24 h，后對菌液進(jìn)行100℃ 10 min滅活，離心后取上清液作為PCR模板。采用VirB8-PCR方法擴(kuò)增布魯氏菌的VirB8基因，進(jìn)行菌屬鑒定。

1.2.6 布魯氏菌的種型鑒定［5］。參照文獻(xiàn)AMOSPCR方法，組合插入序列IS711、牛種（1、2、4、3a 型）、牛種（5、6、9、3b 型）和羊種（1、2、3型）4個引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min、94℃60 s、60℃ 90 s、72℃ 60 s，40個循環(huán)；72℃ 10 min。對布魯氏菌分離株進(jìn)行種型鑒定。

2 結(jié)果

2.1 RBT和SAT

用哈薩克斯坦復(fù)合抗原對82份血清樣品進(jìn)行RBT的檢測中有33份出現(xiàn)凝集，結(jié)果判定為陽性；國產(chǎn)抗原中有10份出現(xiàn)凝集，結(jié)果判為陽性。再分別以復(fù)合抗原和國產(chǎn)抗原為SAT抗原，對RBT檢測結(jié)果為陽性樣品進(jìn)行檢測，其中復(fù)合抗原檢測出陽性樣品30份，國產(chǎn)抗原檢測出陽性樣品20份，結(jié)果見表1。

2.2 MRT

將與被檢血清樣品對應(yīng)的乳樣2 mL分別與復(fù)合抗原和國產(chǎn)抗原各100 μL混勻，40 min后觀察乳樣表層是否有環(huán)狀凝集。其中復(fù)合抗原檢測乳樣中有22份表層出現(xiàn)藍(lán)色環(huán)狀凝集，結(jié)果判定為陽性；國產(chǎn)抗原共檢測出21份乳樣出現(xiàn)紅色環(huán)狀凝集，結(jié)果判定為陽性。結(jié)果見表1 。

2.3 奶樣IELISA實(shí)驗(yàn)

使用西班牙布病奶樣IELISA檢測試劑盒對82份奶樣進(jìn)行了檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有40份奶樣檢測結(jié)果大于臨界值，判定為陽性。

2.4 奶樣分菌

將奶樣300 μL接種于含Brucella添加劑的布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基，5%CO2環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)4 d后，有9份樣品在培養(yǎng)基上生長出圓形、無色、濕潤、凸起的疑似菌落。

表1 血清和奶樣RBT、SAT、MRT和IELISA檢測結(jié)果

2.5 PCR鑒定

應(yīng)用VirB8-PCR方法對疑似布病菌落進(jìn)行PCR鑒定，以A19疫苗株為陽性對照，設(shè)陰性空白對照。VirB8-PCR鑒定結(jié)果顯示，9個疑似菌落中有6個擴(kuò)增出約730 bp的特異性片段，與陽性對照一致，陰性對照未見目的片段，結(jié)果見圖1。

圖1 分離菌株的virB8-PCR鑒定

2.6 布魯氏菌種型鑒定

采用AMOS-PCR方法對VirB8-PCR結(jié)果陽性的分離株進(jìn)行生物亞型鑒定，結(jié)果顯示，在牛種A19疫苗株擴(kuò)增出約500 bp的特異性片段，在羊種M5疫苗株擴(kuò)增出750 bp的目的片段，在6株布魯氏菌分離株全部擴(kuò)增出約750 bp的目的片段，結(jié)果見圖2。

圖2 分離菌株的AMOS-PCR鑒定

3 討論

本研究引進(jìn)的哈薩克斯坦復(fù)合抗原可以同時(shí)對全血、血清、奶樣進(jìn)行檢測，不僅可用于野外臨時(shí)采樣檢測，也可在實(shí)驗(yàn)室中使用同一種抗原進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)。在與國產(chǎn)抗原的血清學(xué)比對實(shí)驗(yàn)中，該抗原的敏感性和檢出率高，易于觀察結(jié)果，對于野外臨檢和基層普檢都有重要的實(shí)際使用價(jià)值。

使用復(fù)合抗原對血清進(jìn)行RBT和SAT實(shí)驗(yàn)，在特異性上較國產(chǎn)RBT和SAT抗原高。兩種抗原在陽性符合率上都較高，在陰性符合率上則明顯降低，說明在檢測過程中有陽性樣品出現(xiàn)了漏檢。兩種MRT抗原在奶樣檢測符合率上較為一致（分別為79.27%和80.49%），但也存在漏檢現(xiàn)象。而布魯氏菌只有在動物體內(nèi)大量增殖時(shí)，奶樣中分菌率才會較高，這也導(dǎo)致本研究中分菌率與血清陽性率存在較大的差異。

本研究從22份牛乳中分離到了6株布魯氏菌羊種3型，說明出現(xiàn)了跨種傳播，并且該種病菌具有在本地區(qū)流行的趨勢。相對于其他亞型布魯氏菌，羊種布魯氏菌對人體的感染性和危害性更大，會嚴(yán)重威脅本地區(qū)的公共安全，應(yīng)對其高度重視。本研究結(jié)果為新疆布魯氏菌病的檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供了重要參考。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

資助項(xiàng)目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技局科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013BA004）；新疆維吾爾自治區(qū)國際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（20136005）；新疆公益性科研院所基金（KY2014008）

Comparison of Diagnostic Methods for Brucellosis and Bacterium Isolation and Identifi cation

Ye Feng1，Ma Xiaojing1，Li Jing2，Yi Xinping1，Gu Wenxi1，Zhong Qi1
（1.Veterinary Research Institute，Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi，Xinjiang 830000；2.Xinjiang Corps Animal Husbandry and Veterinary Work Station，Urumqi，Xinjiang 830000）

Abstract：82 milk samples and 82 serum samples from suspicious brucellosis infected animals were collected.Serum and milk samples were detected by RBT，SAT and MRT by using Kazakhstan complex antigen and domestic antigen respectively.And milk samples were detected by Spain IELISA reagent kit and milk ring test.The positive milk samples in the previous tests were isolated and identifi ed by PCR.The results showed that coincidence rate between using Kazakhstan complex antigen and domestic antigen with IELISA for RBT was 65.85% and 92.68%，coincidence ratefor SAT was 79.52% and 90.24% and coincidence rate for MRT was 79.27% and 80.49%，respectively.Positive milk samples were cultured and used to isolate.Bacterium PCR and AMOS-PCR results showed that the isolates were Brucella melitensis.The results showed that false negatives were existed in MRT detection for milk and sera by using Kazakhstan complex antigen and domestic antigen.Brucella melitensis was isolated from milk，which demonstrated that the disease spread across the species.It should be paid much attention to.

Key words：brucellosis；diagnostic method；comparison；identifi cation

中圖分類號：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）02-0066-04

通訊作者：鐘 旗