文/貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 劉金平

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應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)檢測獸藥殘留的研究進(jìn)展

文/貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 劉金平

摘 要高效液相色譜是一種高效而快速的分離與分析技術(shù)，是目前分離檢測經(jīng)常用到的重要方法。因其具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單、工作時(shí)間短、可準(zhǔn)確分析測定樣品等特點(diǎn)而發(fā)展迅速，備受人們青睞。文章通過對近幾年來國內(nèi)外發(fā)表的具有代表性的相關(guān)文章進(jìn)行分析整理和歸納，綜述了高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展和在獸醫(yī)藥理學(xué)中應(yīng)用的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞高效液相色譜；質(zhì)譜；獸醫(yī)藥理學(xué)；獸藥殘留

色譜法是指利用待測樣品中各組分在兩相中分配系數(shù)不同，當(dāng)流動相推動樣品中的組分運(yùn)動并通過固定相時(shí)，固定相根據(jù)不同物質(zhì)在不同相態(tài)下進(jìn)行選擇性分配，在兩相中進(jìn)行連續(xù)反復(fù)多次分配，從而形成差速移動，不同的物質(zhì)會以不同的速度以固定相移動最終實(shí)現(xiàn)分離［1，2］。根據(jù)流動相的狀態(tài)可將色譜法分為氣相色譜法和液相色譜法。液相色譜技術(shù)經(jīng)過40多年的發(fā)展已在諸多領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用［3～5］。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是在經(jīng)典的液體柱色譜基礎(chǔ)上，引入氣相色譜技術(shù)的理論，采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，達(dá)到了高速分離、高靈敏度和操作自動化等目的，從而實(shí)現(xiàn)樣品的快速檢測和分析［6］。此法與氣相色譜的主要區(qū)別在于流動相是液體而不是氣體，與氣相色譜法相比，由于不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，所以應(yīng)用范圍更廣泛，特別適合于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析分離［7］。鑒于高效液相色譜所具有的優(yōu)點(diǎn)，使更多的人越來越重視對其的研究，高效液相色譜的應(yīng)用也越來越普遍，這不僅減少了工作的繁雜，也使所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可靠。

隨著研究工作的不斷深入，高效液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)也已經(jīng)出現(xiàn)，并投入到市場使用［8］。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是在高效液相色譜的高分離能力基礎(chǔ)上［9］，利用質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度以及能夠準(zhǔn)確提供化合物的相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息等特點(diǎn)設(shè)計(jì)，具有分析時(shí)間短，對高沸點(diǎn)、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物的分析能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［10］。

1 高效液相色譜

1.1 高效液相色譜的構(gòu)造

高效液相色譜主要由貯液罐、高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀以及數(shù)據(jù)處理裝置8部分組成［11］。

1.2 高效液相色譜的工作原理

高效液相色譜是利用高壓泵將貯液罐中的流動相送入色譜儀系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，隨流動相流動而被運(yùn)入色譜柱中，由于樣品溶液中的各個(gè)組分在流動相和固定相中的分配系數(shù)不同，因此在兩相中會做相對運(yùn)動，經(jīng)過不斷流動分配，樣品中各混合組分之間漸漸拉開距離，最終以相互分離的單個(gè)組分存在，然后依次從柱內(nèi)流出，利用檢測器的傳感器將樣品濃度轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，以圖譜形式將樣品數(shù)據(jù)打印出來［12］。

1.3 高效液相色譜法的特點(diǎn)

與傳統(tǒng)的色譜法相比，高效液相色譜法有很多優(yōu)點(diǎn)。①顆粒極細(xì)的固定相使流動阻力降低，有效提高了固定相的效率，使分離更加精確。②采用高壓輸送系統(tǒng)提高流動相的流動速度，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，從而減少操作人員的工作量。③采用高靈敏度檢測器，檢測靈敏度高，紫外檢測器可達(dá)0.01ng。④通過流動相可以控制和改善分離過程，同時(shí)色譜柱具有高柱效，因此具有高選擇性，既可分析同分異構(gòu)體，又可分析旋光異構(gòu)體［13］。

2 高效液相色譜的現(xiàn)狀

2.1 高效液相色譜的發(fā)展

隨著科技的不斷發(fā)展，科研工作者對高效液相色譜技術(shù)的應(yīng)用越來越普遍。高效液相色譜的發(fā)展始于20世紀(jì)60年代中后期［14］。20世紀(jì)60年代末期，世界上第一臺高效液相色譜儀出現(xiàn)，從此開啟了高效液相色譜的時(shí)代，受到很多科研工作者的關(guān)注，并且迅速發(fā)展起來。后來逐漸出現(xiàn)分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、凝膠色譜［15］，目前高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已投入使用，這使數(shù)據(jù)分析更加快捷方便。

2.2 高效液相色譜的應(yīng)用

通過查閱國內(nèi)外的參考文獻(xiàn)，高效液相色譜應(yīng)用非常廣泛。喬坤云等［16］通過高效液相色譜熒光法同時(shí)檢測了雞肉中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星4種氟喹諾酮類藥物殘留的情況。楊遠(yuǎn)高等［17］研究表明，高效液相色譜用于分離測定虎杖中白藜蘆醇，高良姜中槲皮素、山奈酚、高良姜素，小兒瀉速停顆粒中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素幾種中草藥效果都非常好，并且該方法簡便快速、靈敏度高、成本低、綠色環(huán)保，可用于該制劑的質(zhì)量控制。蔡良英等［18］運(yùn)用高效液相色譜方法快速地測定雞蛋中三聚氰胺殘留含量，該方法操作相對簡單，運(yùn)行成本低，是目前最為常用的檢測方法。張吟等［19］通過研究發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜可以用于分析測定血漿中多種藥物。王媛等［20］用固相萃取-高效液相色譜法分析測定減肥食品中是否添加雙氫克尿噻、呋噻米、克羅帕米、布美他尼和鹽酸西布曲明等藥物，用于違禁藥物的檢測。

3 高效液相色譜在獸醫(yī)藥理學(xué)研究中的應(yīng)用

我國是農(nóng)業(yè)大國，畜牧業(yè)的發(fā)展受到國家的高度重視，各種保健類和治療類獸藥是經(jīng)常用到的，各類獸藥在使用時(shí)會出現(xiàn)一些不良癥狀，如應(yīng)激反應(yīng)，畜禽體內(nèi)發(fā)生耐藥性［21，22］，甚至在很多肉類食品中出現(xiàn)嚴(yán)重的獸藥殘留［23］，對人們生活造成嚴(yán)重影響。這引起科研工作者對獸醫(yī)藥理學(xué)的研究更加重視。在進(jìn)行獸藥殘留的檢測時(shí)，普遍使用的就是高效液相色譜技術(shù)，目前高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)更受歡迎。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀主要由高效液相色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜系統(tǒng)兩部分組成，樣品由液相系統(tǒng)進(jìn)入，經(jīng)色譜柱分離，被分離的組分依次進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，在離子源中離子化，離子聚焦于質(zhì)量分析器中，根據(jù)質(zhì)荷比而分離，分離后的離子信號轉(zhuǎn)化為電信號，傳遞至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù)質(zhì)譜峰的強(qiáng)度和位置對樣品的成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析［24］。該方法可以快速準(zhǔn)確地測定、分析數(shù)據(jù)。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在獸藥殘留方面應(yīng)用的報(bào)道已經(jīng)非常多［25］。李小玲等［26］建立的測定諾氟沙星、環(huán)丙沙星與恩諾沙星藥物殘留的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，樣品經(jīng)乙腈提取，正己烷脫脂，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，即可進(jìn)行定性和定量分析。該測定方法成本低，而且時(shí)間短。周萍等［27］通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測定蜂王漿中甲硝唑、洛峭噠哇、二甲峭咪哇3種硝基咪哇類藥物殘留的含量，有力地說明了該方法可作為峭基咪哇類藥物在蜂王漿中殘留的含量快速檢測方法。李向軍等［28］建立的同時(shí)測定24種性激素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)現(xiàn)了3類性激素的同時(shí)定量及定性確證分析。潘曉東等［29］建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定魚肉中氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟甲砜霉素（FF）殘留含量，并用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)充分地說明該方法具有良好的選擇性、靈敏度和準(zhǔn)確度，滿足魚肉中痕量氯霉素類藥物殘留的高靈敏分析需要。熊春蘭等［30］建立了高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法同時(shí)測定水產(chǎn)品中喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、磺胺增效劑、林可胺類、硝基咪唑類、喹啉類和多肽類8類共38種限用獸藥殘留的含量，該法方便快捷，可同時(shí)對多種獸藥殘留進(jìn)行快速測定。

4 結(jié)語

高效液相色譜技術(shù)是目前公認(rèn)的操作簡單、工作時(shí)間較短、能夠快速測定分析藥物的方法，但是隨著社會的進(jìn)步，科技的不斷發(fā)展，為了預(yù)防和治療一些新型疾病，各種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的新型藥物不斷問世，新藥的耐藥性、在體內(nèi)分布情況等都是人們需要進(jìn)一步解決的問題。單純地應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)已經(jīng)很難滿足實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測定分析的要求，在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)完成對一種或幾種藥物的測定分析、確定藥物在機(jī)體內(nèi)的分布情況、藥物在體內(nèi)的作用位點(diǎn)等都是有待解決的問題。為了解決這些問題，現(xiàn)已經(jīng)出現(xiàn)在高效液相色譜的基礎(chǔ)上，結(jié)合質(zhì)譜的特點(diǎn)發(fā)明了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，解決了部分存在的問題，但是仍存在很多不足，需要進(jìn)一步改進(jìn)，如何提高高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的靈敏度和精度是以后高效液相色譜技術(shù)發(fā)展的研究方向。色譜聯(lián)用技術(shù)還有著很大的發(fā)展空間，新的色譜聯(lián)用技術(shù)有待探索使用?？梢钥闯觯鞣N新型色譜聯(lián)用技術(shù)的廣泛應(yīng)用必將對現(xiàn)代研究起到重要的推動作用。

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