田華捷+馮琴+胡義揚(yáng)

摘 要 肝纖維化的無(wú)創(chuàng)診斷對(duì)慢性肝病的進(jìn)展、預(yù)后和治療療效的評(píng)估具有重要意義。本文系統(tǒng)回顧和分析總結(jié)近20年來肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷的研究進(jìn)展，包括血清學(xué)檢測(cè)及其數(shù)學(xué)模型、影像學(xué)檢查、血清分子生物學(xué)新檢測(cè)技術(shù)等診斷方法在肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值和局限性，并提出基于系統(tǒng)生物學(xué)的生物標(biāo)志物的篩選和超聲波肝臟彈性檢測(cè)方法的優(yōu)化可能是今后的重要研究方向。

關(guān)鍵詞 肝纖維化 無(wú)創(chuàng)診斷 影像學(xué) 血清學(xué)標(biāo)志物 基因組學(xué)

中圖分類號(hào)：R575.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2016）13-0024-05

Research status of non-invasive diagnosis of liver fibrosis*

TIAN Huajie1**， FENG Qin1， HU Yiyang1，2***（1. Shuguang Hospital & Institute of Hepatology， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China；

2. Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases， Ministry of Education， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Non-invasive diagnosis of liver fibrosis plays an important role in the progression， prognosis and curative effect evaluation of chronic liver disease. In this paper， the research progress of liver fibrosis non-invasive diagnosis in recent 20 years was systematically reviewed and summarized， including clinical application value and limitations of serum marker， serologic diagnostic models， serum molecular biology technology and imaging examination. It was suggested that the screening of biomarkers based on systems biology and the optimization of ultrasonic liver elasticity imaging detection would be an important research direction in the future.

KEY WORDS liver fibrosis； non-invasive diagnosis； imaging； serum biomarkers； genomics

肝纖維化是病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病和膽汁淤積性肝病等各種慢性肝病共有的病理過程[1]，主要特征在于肝竇內(nèi)的肝星狀細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積[2]?，F(xiàn)已明確，肝纖維化是可逆的。目前，肝纖維化診斷的“金”方法仍然是肝穿刺后的組織學(xué)檢查。由于肝組織的活組織檢查術(shù)是創(chuàng)傷性檢查，存在不易被患者接受、有潛在風(fēng)險(xiǎn)、取樣局限性可能影響肝纖維化程度評(píng)估的準(zhǔn)確性（可能存在25%的差異[3]）和難以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝纖維化程度的變化及治療效果等問題，因此尋找低成本、低風(fēng)險(xiǎn)、高效率的肝纖維化無(wú)創(chuàng)評(píng)估與診斷方法一直是肝纖維化研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)[4-5]，而其對(duì)了解疾病的進(jìn)展、預(yù)后和治療療效的評(píng)估具有重要的臨床意義。

目前，肝纖維化的無(wú)創(chuàng)診斷方法主要包括血清學(xué)檢測(cè)及其數(shù)學(xué)模型、影像學(xué)檢查、血清分子生物學(xué)新檢測(cè)技術(shù)等診斷方法。近年來，以綜合多項(xiàng)臨床、生化指標(biāo)為基礎(chǔ)的肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷模型和通過檢測(cè)肝臟硬度值（liver stiffness）來反映肝纖維化程度的瞬時(shí)彈性成像術(shù)（transient elastography， TE）受到廣大專家學(xué)者的關(guān)注和認(rèn)可。此外，隨著宏觀基因組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，一部分專家學(xué)者也在致力于尋找能夠靈敏、準(zhǔn)確地反映肝纖維化程度的新的血清學(xué)診斷標(biāo)志物，并取得了一定的進(jìn)展。

1 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷標(biāo)志物主要分為間接和直接標(biāo)志物兩大類。間接標(biāo)志物是指可反映肝損傷及炎癥程度的相關(guān)指標(biāo)，包括血小板、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、α2-巨球蛋白、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase， GGT）、總膽紅素和載脂蛋白A1等，它們的水平變化能反映肝功能的變化，但無(wú)法準(zhǔn)確地反映肝纖維化的程度。直接標(biāo)志物是指可反映肝組織細(xì)胞外基質(zhì)變化以及與細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)化、纖維化形成和分解有關(guān)的物質(zhì)，如透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原氨基末端肽（procollagen type III amino-terminal peptide， PIIINP）、Ⅰ型和Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）、金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMP）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1等。其中，透明質(zhì)酸為細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的糖胺多糖成分，其水平可較準(zhǔn)確、靈敏地反映肝內(nèi)已生成的纖維量及肝細(xì)胞的受損、炎癥活動(dòng)狀況，且對(duì)不同原因引起的肝纖維化均有很好的診斷價(jià)值[6]；層粘連蛋白為基底膜中特有的非膠原性糖蛋白，其水平與肝纖維化活動(dòng)程度和門靜脈壓力均呈正相關(guān)性，但用來判斷肝纖維化程度尚不夠靈敏，只能用來判斷肝纖維化活動(dòng)程度。Li等[7]在87例慢性乙型肝炎患者中比較了血清透明質(zhì)酸和層粘連蛋白水平對(duì)肝纖維化的診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用血清透明質(zhì)酸水平診斷肝纖維化的敏感性、特異性、陽(yáng)性診斷率和陰性診斷率分別為84.2%、83.3%、90.6%和73.5%，而使用血清層粘連蛋白水平診斷肝纖維化的敏感性、特異性、陽(yáng)性診斷率和陰性診斷率分別為71.9%、80.0%、87.2%和60.0%。血清PIIINP水平反映了肝臟膠原的合成、代謝狀況，可用來動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝纖維化的活動(dòng)性；血清Ⅳ型膠原的水平變化可較靈敏地反映肝纖維化過程，故是肝纖維化早期的診斷標(biāo)志物之一。此外，肝細(xì)胞膜分泌的一類具有調(diào)節(jié)基質(zhì)降解作用的蛋白（MMP、TIMP等）與肝纖維化的發(fā)生和細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)，其水平也可用來評(píng)估肝纖維化程度[8-11]。Boeker等[12]研究發(fā)現(xiàn)，使用血清TIMP-1水平預(yù)測(cè)早期肝硬化的敏感性達(dá)100%，特異性為56% ～ 75%。但總體而言，對(duì)肝纖維化診斷，使用單一血清標(biāo)志物的敏感性和特異性較低，且往往還易受到諸多其他因素如肝臟炎癥、肝臟代謝或清除能力下降等的影響，診斷價(jià)值有限，僅僅只能用作參考[13]。

2 血清學(xué)診斷的數(shù)學(xué)模型

為了提高肝纖維化血清學(xué)無(wú)創(chuàng)診斷的效率，近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者建立了多種基于多項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)的診斷模型。這些模型一般可分為兩類，其中一類是以臨床常規(guī)檢查指標(biāo)為參數(shù)構(gòu)成的簡(jiǎn)單模型，包括AAR（AST與ALT水平的比值）、APRI（ALT與血小板水平的比值指數(shù)）、FIB-4指數(shù)和Forns指數(shù)等。AAR≥1對(duì)肝硬化診斷的敏感性為53%，特異性為100%，受試者工作特征曲線下面積（area under the receiver operating characteristic curve， AUC）為0.57，陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值分別為100%和80.7%[14]。與AAR相比，APRI可更簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)重度肝纖維化和肝硬化，但是無(wú)法區(qū)分患者肝纖維化程度的不同。Lin等[15]對(duì)40項(xiàng)合計(jì)包括8 739例慢性丙型肝炎患者的研究數(shù)據(jù)的meta分析顯示，當(dāng)肝纖維化分期≥2和3期時(shí)，使用APRI診斷的AUC分別為0.77和0.80，敏感性分別為77%和72%，特異性分別為61%和64%。FIB-4指數(shù)由年齡、血小板計(jì)數(shù)、AST和ALT構(gòu)成。Amorim等[16]分析了FIB-4指數(shù)和APRI對(duì)慢性丙型肝炎患者肝纖維化診斷的AUC，發(fā)現(xiàn)分別為（0.811±0.045）和（0.793±0.047）。Forns指數(shù)由年齡、GGT、膽固醇和血小板計(jì)數(shù)構(gòu)成，診斷慢性丙型肝炎患者肝纖維化的敏感性和特異性分別為94%和81%，AUC為（0.853±0.017）[17]。但因Forns指數(shù)用到的指標(biāo)膽固醇其水平受到慢性丙型肝炎基因型的影響，故該模型具有局限性，尤其是用于亞洲患者時(shí)。

另一類診斷模型是包含了肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)的模型，包括Fibrotest、FibroSpect II、FibroMeter、Hepascore、上海肝纖維化組（Shanghai Liver Fibrosis Group， SLFG）模型和FibroIndex等。Fibrotest由GGT、α2-巨球蛋白、總膽紅素、肝珠蛋白-2和載脂蛋白A1構(gòu)成，但需根據(jù)患者年齡和性別進(jìn)行調(diào)整。Poynard等[18]的meta分析顯示，F(xiàn)ibrotest對(duì)慢性乙型肝炎患者進(jìn)展期肝纖維化診斷的AUC為0.84，再次驗(yàn)證了Fibrotest對(duì)肝纖維化的診斷價(jià)值[19]。不過，在臨床實(shí)踐中，F(xiàn)ibrotest易受急性炎癥因素的影響，導(dǎo)致因α2-巨球蛋白和肝珠蛋白-2水平升高而出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性[20]。FibroSpect II由透明質(zhì)酸、TIMP-1和α2-巨球蛋白構(gòu)成，診斷慢性丙型肝炎患者肝纖維化的AUC為0.831，敏感性和特異性分別為83%和66%，陽(yáng)性和陰性診斷率分別為74.3%和75.8%，總準(zhǔn)確率為75%[21]。FibroMeter由血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原指數(shù)、AST、α2-巨球蛋白、透明質(zhì)酸、尿素氮和年齡構(gòu)成，診斷慢性乙型肝炎相關(guān)的顯著性肝纖維化、晚期肝纖維化和肝硬化的能力較強(qiáng)，AUC分別為0.778 ～ 0.85、0.876 ～ 0.94和0.836[22-23]。Hepascore由膽紅素、透明質(zhì)酸、α2-巨球蛋白、GGT、年齡和性別構(gòu)成，是專為慢性丙型肝炎患者建立的診斷模型，在建模組中診斷顯著性肝纖維化、晚期肝纖維化和肝硬化的AUC分別為0.85、0.96和0.94，在驗(yàn)證組中診斷顯著性肝纖維化、晚期肝纖維化和肝硬化的AUC分別為0.82、0.90和0.89；在Hepascore≥0.5時(shí)診斷顯著性肝纖維化的敏感性為95%、特異性為92%，在Hepascore≥0.84時(shí)診斷肝硬化的敏感性為71%、特異性為84%[24]。SLFG模型由上海肝纖維化組建立，由α2-巨球蛋白、年齡、GGT和透明質(zhì)酸構(gòu)成，在建模組和驗(yàn)證組中診斷肝纖維化的AUC分別為0.84和0.77[25]。FibroIndex由年齡、血小板計(jì)數(shù)、GGT和透明質(zhì)酸構(gòu)成，判斷不同分期肝纖維化的AUC均在0.88左右。根據(jù)3個(gè)界值2.2、3.0和5.4分別設(shè)定不同程度肝纖維化的排除標(biāo)準(zhǔn)，使用FibroIndex可篩選出81%的無(wú)肝纖維化患者而使他們避免肝活組織檢查術(shù)，并使75%以上的無(wú)重度肝纖維化或早期肝硬化患者得到鑒別，且后2個(gè)界值的陰性預(yù)測(cè)率高達(dá)90%以上[26]。

由于疾病譜的差異，國(guó)際上各種肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷模型絕大多數(shù)是在慢性丙型肝炎、其次是在酒精性肝病患者中建立并進(jìn)行驗(yàn)證的，而我國(guó)的慢性肝病以慢性乙型肝炎為主，故這些模型是否適用于我國(guó)慢性乙型肝炎患者，還是我國(guó)建立的診斷模型更符合國(guó)情，抑或是多模型綜合運(yùn)用的診斷準(zhǔn)確性更高，尚待進(jìn)一步的研究。此外，雖然這些診斷模型有的已在辨別無(wú)或輕度肝纖維化以及早期肝硬化方面成功地發(fā)揮了作用，但它們對(duì)中度肝纖維化的判斷能力仍有待提高。值得一提的是，聯(lián)合運(yùn)用2 ～ 3種診斷模型可有效地提高診斷的準(zhǔn)確性?？傮w而言，血清學(xué)無(wú)創(chuàng)診斷模型具有如下優(yōu)點(diǎn)：無(wú)創(chuàng)性，能全面反映患者的整體狀況并減少脂肪、體重和腹水等因素的干擾；易于反復(fù)使用，便于在治療過程中對(duì)患者的復(fù)查和隨訪；與肝活組織檢查術(shù)相比，在風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用方面均更易被患者接受。但隨著國(guó)內(nèi)外研究的深入，血清學(xué)無(wú)創(chuàng)診斷模型的缺點(diǎn)也逐漸顯現(xiàn)，包括對(duì)這些模型的使用尚缺乏統(tǒng)一的選用標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)、診斷的可靠性尚不明確和計(jì)算比較繁瑣等。

3 影像學(xué)診斷

肝纖維化的影像學(xué)診斷因具有無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)、高效等特點(diǎn)，一直是臨床上的重要方法和手段之一，常用手段包括超聲波、計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography， CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging， MRI）檢查等，對(duì)肝纖維化的診斷依據(jù)均為肝臟形態(tài)學(xué)的改變。研究發(fā)現(xiàn)，B超檢查對(duì)肝硬化診斷的準(zhǔn)確率約為80%，但用于輕、中度肝纖維化診斷不敏感[27]。CT和MRI檢查在診斷肝臟彌漫性病變上的價(jià)值遠(yuǎn)不如診斷肝內(nèi)占位性病變，不敏感且缺乏特異性[28]，同時(shí)費(fèi)用高，故不推薦用作肝纖維化或肝硬化的常規(guī)檢查手段。近年發(fā)展起來的TE、聲輻射力脈沖成像（acoustic radiation force impulse， ARFI）和磁共振彈性成像（magnetic resonance elastography， MRE）技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好且具有較高的敏感性和特異性，已顯示具有較高的肝纖維化診斷價(jià)值。

Fibroscan是最早用于臨床的一種TE技術(shù)，檢測(cè)慢性肝炎患者的肝臟硬度值和評(píng)估肝纖維化進(jìn)展的有效性已得到臨床實(shí)踐的證實(shí)，且為各國(guó)相關(guān)臨床指南所推薦。Afdhal等[29]在美國(guó)748例慢性丙型肝炎或慢性乙型肝炎患者中比較了Fibroscan和肝活組織檢查術(shù)診斷肝纖維化的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示Fibroscan的診斷準(zhǔn)確性更高。Seo等[30]在韓國(guó)慢性病毒性肝炎患者中的研究亦得到了相同的結(jié)論。但Fibroscan也有局限性：一方面，F(xiàn)ibroscan的檢測(cè)結(jié)果往往受到操作者主觀感受的影響，因此需由經(jīng)驗(yàn)豐富的工作人員來操作，且檢測(cè)結(jié)果的闡釋也需結(jié)合患者的臨床資料和其他影像學(xué)、內(nèi)鏡和生化檢查結(jié)果作綜合分析；另一方面，F(xiàn)ibroscan的檢測(cè)成功率受到患者肥胖和肋間隙大小等因素的影響，檢測(cè)值又受到肝臟脂肪變、炎性壞死和膽汁淤積的影響，且不易準(zhǔn)確區(qū)分相鄰分期的肝纖維化[31]。近期，國(guó)內(nèi)發(fā)展的相似技術(shù)FibroTouch也已開始用于臨床，并取得了較滿意的效果。袁利超等[32]在75例慢性乙型肝炎患者中比較了FibroTouch與Fibroscan的肝纖維化評(píng)估效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組患者的肝臟硬度值分別為（7.8±5.7）和（8.0±5.8）kPa，但配對(duì)t檢驗(yàn)顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.17， P=0.861 6）。

不同于TE技術(shù)，ARFI技術(shù)運(yùn)用了二維超聲波成像技術(shù)，而該技術(shù)可嵌入常規(guī)超聲波掃描儀中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝實(shí)質(zhì)的檢測(cè)，并具有可任意選點(diǎn)、多點(diǎn)和多次取樣，適用于彌漫性、不均勻性和局灶性病變，以及有多普勒、聲學(xué)造影和穿刺功能的特點(diǎn)。MRE技術(shù)可直觀顯示通過肝組織的剪切聲波，可用于定量檢測(cè)和評(píng)估整個(gè)肝臟，避免取樣誤差，有望成為肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷的新“金標(biāo)準(zhǔn)”。Batheja等[33]的研究顯示，MRE技術(shù)用于檢測(cè)和評(píng)估肝纖維化是可行和有效的，特別是用于鑒別F0 ～ F2和F3 ～ F4級(jí)肝纖維化。不過，盡管已有這些可喜的進(jìn)展，但仍有許多問題需要解決，如上述無(wú)創(chuàng)診斷方法的診斷效力、肝纖維化分級(jí)的界點(diǎn)和閾值、診斷成本、推廣使用的可行性等。

4 血清分子生物學(xué)新診斷技術(shù)

近10年來，隨著第二代功能測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)和蛋白組學(xué)、尤其是微小RNA（microRNA， miRNA）在肝纖維化動(dòng)態(tài)評(píng)估中的作用越來越重要。miRNA是以序列特異性方式調(diào)控基因表達(dá)的一類非編碼蛋白的單鏈小分子RNA，在肝臟疾病患者中呈差異性表達(dá)，提示miRNA可能參與調(diào)控著肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。Venugopal等[34]采用膽管結(jié)扎法建立大鼠肝纖維化模型，使用mirVana miRNA分離試劑盒從其肝星狀細(xì)胞中分離得到包括miRNA在內(nèi)的總RNA，純化后再進(jìn)行miRNA水平譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠肝星狀細(xì)胞中的miR-150和miR-194水平下降，而它們水平升高可使α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原表達(dá)下降，故推測(cè)這2個(gè)miRNA可用作肝纖維化診斷及治療療效評(píng)估的標(biāo)志物。Guo等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，在肝星狀細(xì)胞活化過程中有12個(gè)miRNA水平升高、9個(gè)miRNA水平降低；miR-15b和miR-16可直接誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡。Murakami等[36]采用給小鼠腹腔灌注四氯化碳建立肝纖維化模型，然后分別取4、6和8周后的模型小鼠肝組織進(jìn)行miRNA水平譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-199a、miR-200a和miR-200b水平與肝纖維化分期呈一致性改變，而它們水平升高則可使肝星狀細(xì)胞中的纖維化相關(guān)基因表達(dá)顯著增加，由此推測(cè)這些miRNA可用作肝纖維化診斷及治療療效評(píng)估的標(biāo)志物。

有關(guān)miRNA的研究雖已取得了一定的進(jìn)展，為早期肝纖維化的無(wú)創(chuàng)診斷提供了新的途徑，但miRNA水平存在較大的人群、人種差異并與生活環(huán)境和遺傳因素等有關(guān)，因此離臨床應(yīng)用還有相當(dāng)?shù)木嚯x。

5 展望

理想的肝纖維化診斷方法應(yīng)具備無(wú)創(chuàng)性、高度的準(zhǔn)確性和敏感性，以及肝臟特異性、易于檢測(cè)和能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病的變化等特性。肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷方法的研究已在過去數(shù)十年中取得了一定的進(jìn)展，其中以血清學(xué)指標(biāo)為基礎(chǔ)建立的無(wú)創(chuàng)診斷模型以Fibroscan為代表，其在肝纖維化診斷上具有較高的實(shí)用價(jià)值。不過，因診斷結(jié)果在肝纖維化分期上缺乏精準(zhǔn)性，故目前無(wú)法完全替代肝活組織檢查術(shù)。肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷方法的今后研究方向?qū)?huì)聚焦在已有無(wú)創(chuàng)診斷模型的優(yōu)化以及開發(fā)新的血清學(xué)和影像學(xué)無(wú)創(chuàng)診斷方法方面，尤其是基于系統(tǒng)生物學(xué)的生物標(biāo)志物的篩選和超聲波肝臟彈性檢測(cè)方法的優(yōu)化可能是今后的重要研究方向。我們相信，在不久的將來，肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷方法的準(zhǔn)確性和特異性必能得到進(jìn)一步的提高，從而對(duì)慢性肝病相關(guān)肝纖維化的防治產(chǎn)生積極的影響。

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