漢中毛竹葉黃酮提取及抗氧化穩(wěn)定性研究

史娟，李江，葛紅光（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

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漢中毛竹葉黃酮提取及抗氧化穩(wěn)定性研究

史娟，李江，葛紅光
（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

摘要：以漢中毛竹葉為原料，采用超聲波預(yù)處理-乙醇回流法提取竹葉黃酮。在不同的液固比、乙醇濃度、回流溫度和回流時間下，探討最佳提取工藝；并對黃酮的抗氧化穩(wěn)定性進行研究。研究結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL），乙醇濃度為70%，回流溫度為70℃，回流時間為120min時，竹葉黃酮提取率最高為2.917%?？寡趸囼灡砻?，pH、光照時間、Cu2+、Zn2+以及Al3+對抗氧化能力影響較大，金屬離子Na+、Ca2+、Mg2+對竹葉黃酮清除DPPH自由基（二苯代苦肼基自由基）的能力影響相對較小。

關(guān)鍵詞：竹葉；黃酮；提取；抗氧化；穩(wěn)定性

毛竹，禾本科剛竹屬，又名“楠竹”、“孟宗竹”等，在秦嶺、漢水流域、長江以南和臺灣省及黃河流域多見栽培。漢中地處秦巴山區(qū)，植被種類豐富，氣候、土壤情況適合楠竹種植?，F(xiàn)有楠竹資源豐富，并計劃打造西北最大竹海，完成500萬畝楠竹種植，未來將有豐富的竹資源可用于開發(fā)。竹葉在我國具有悠久的食用和藥用歷史，有效成分包括黃酮、酚酮、蒽醌、內(nèi)酯、多糖、氨基酸、微量元素等［1］。已有文獻表明竹葉黃酮具有作為天然抗氧化劑的開發(fā)潛力［2］，金毛竹葉提取物可顯著抑制由AAPH（偶氮二異丁脒鹽酸鹽）誘導(dǎo)的脂質(zhì)體的過氧化［2-3］；竹葉黃酮還具有較好的調(diào)節(jié)血脂作用［4-5］；食物或飲品等中加入竹葉提取物，可使其抗氧化性能和儲存穩(wěn)定性大大增強［6-7］。又因竹葉黃酮類化合物原料來源豐富、食用安全性高且具有清新甜香的竹子風(fēng)味，故在天然功能性食品添加劑及醫(yī)藥保健品領(lǐng)域具有較好前景［8］。本研究以竹葉為原料，以單因素與正交試驗考察提取條件對竹葉竹葉黃酮的得率的影響，并對其抗氧化穩(wěn)定性進行研究，為漢中地區(qū)竹葉資源的開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮竹葉：采自漢中楠竹園；蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）：美國Sigma－Aldrich公司。

無水乙醇、石油醚、亞硫酸鈉、硝酸鋁、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化銅、氯化鋅、氯化鋁及其它試劑均為分析純。

1.2主要儀器

DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；FW117粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；AL204-IC型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；SB-200DT超聲波清洗機：寧波新芝生物科技有限公司；RE-2A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TDL-5臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；721型分光光度計、PHS-3S型pH酸度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1竹葉的前處理

將竹葉用自來水洗凈、瀝干，置于烘箱，60℃下烘干并用研缽研細(xì)，密封備用。

1.3.2竹葉黃酮提取流程

稱取一定質(zhì)量的竹葉粉末，加入一定濃度乙醇為提取溶劑，超聲波預(yù)處理30 min后（超聲功率700 W、頻率100 kHz），在一定液料比、溫度條件下提取一定時間，抽濾，濾液濃縮后加入蒸餾水，除去水不溶性雜質(zhì)，再次過濾，加入石油醚萃取，收集下層為樣品提取液，加蒸餾水定容后，待測。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及回歸方程的建立

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品7.5 mg，加入乙醇定容至50 mL，配成0.15 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，移入10 mL刻度比色管中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻后放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液2 mL，乙醇定容至刻度，10 min后在510 nm處測定不同濃度蘆丁的吸光度。用最小二乘法做線性回歸，得蘆丁濃度C（mg/mL）與吸光度A的回歸方程式：A=17.519C-0.011，R2= 0.999 3，蘆丁濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

1.4竹葉黃酮提取的單因素試驗

以竹葉黃酮提取率為指標(biāo)分別考察液固比、乙醇濃度、回流溫度和回流時間4個因素對提取率的影響，每個因素設(shè)定5個梯度，進行單因素試驗，各單因素試驗重復(fù)3次，并取平均值。

1.5竹葉黃酮提取的正交試驗設(shè)計

參照單因素試驗結(jié)果，設(shè)計L9（34）試驗以確定竹葉黃酮提取的最佳工藝條件，各因素水平的設(shè)定如表1所示。

表1　L9（34）正交試驗因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal experiments

1.6竹葉黃酮抗氧化穩(wěn)定性試驗

1.6.1竹葉黃酮對DPPH自由基的活性測定

采用清除DPPH自由基（二苯代苦肼自由基）的能力，測定竹葉黃酮抗氧化活性［9］。測定時，將待測竹葉黃酮試樣配制成系列溶液，測定各濃度竹葉黃酮試樣對DPPH自由基清除率。并以樣品濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖，得到竹葉黃酮濃度與自由基清除率的關(guān)系。

1.6.2竹葉黃酮抗氧化穩(wěn)定性

在510 nm波長下，通過測定竹葉黃酮在不同溫度、pH值、金屬離子等條件下吸光度值的變化，對其抗氧化活性的穩(wěn)定性進行研究。

1.7數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，取平均值，數(shù)據(jù)分析采用Origin8.0軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素對竹葉黃酮提取效果的影響

2.1.1最佳料液比的確定

準(zhǔn)確稱取竹葉粉末2 g，按1.3.2超聲預(yù)處理后，固定提取溫度為80℃，以70%乙醇為溶劑，改變料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）的回流提取60 min后，測定吸光度，研究料液比對竹葉黃酮提取率的影響，見圖1。

圖1　 料液比對黃酮提取率的影響Fig.1　Effect of material/liquid ratio on flavone yield

由圖1結(jié)果發(fā)現(xiàn)料液比1∶25（g/mL）時，樣品提取測得的吸光度最大。當(dāng)料液比較大時，提取率低的原因是溶劑用量少，原料浸潤不完全，故而影響提取效果；而溶劑過多則會吸收超聲波輻射能量，因而影響多糖的析出，且易導(dǎo)致其他組分同時析出，從而影響產(chǎn)率。

2.1.2最佳乙醇濃度的確定

同于2.1.1提取方法，稱取5份相同質(zhì)量（2.0 g）竹葉粉末，分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇50 mL，80℃下回流提取60 min，并測定黃酮含量。乙醇濃度對黃酮提取率的影響見圖2。

圖2　乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.2　Effect of ethanol concentration on flavone yield

圖2結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇濃度70%時，樣品提取率最大，因此以70%的乙醇為最佳提取濃度。

2.1.3最佳回流溫度的確定

以70%乙醇為提取溶劑，按照1∶25（g/mL）料液比，分別在60、65、70、75、80℃的溫度下，回流竹葉樣品60 min，測定含量，結(jié)果見圖3。

圖3　提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on flavone yield

圖3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取溫度70℃時，樣品提取測得的吸光值最大，因此以70℃的提取溫度最佳。

2.1.4最佳回流時間的確定

取2.0 g竹葉樣品5份，加入70%乙醇50 mL，超聲預(yù)處理后，在70℃下分別回流提取30、60、90、120、150 min，測定黃酮含量，結(jié)果見圖4。

圖4　提取時間對黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of extraction time on flavone yield

圖4結(jié)果表明，隨著提取時間的增長，竹葉黃酮的提取率逐漸上升，在90 min～120 min時基本達到最大值?？紤]到90 min和120 min差別不大，黃酮的溶出已達到平衡；繼續(xù)延長時間，可能導(dǎo)致黃酮類結(jié)構(gòu)被破壞，提取率降低，所以90 min為提取適宜時間。

2.2竹葉黃酮提取效果的正交試驗結(jié)果

2.2.1正交試驗結(jié)果

采用超聲波預(yù)處理-乙醇回流法提取竹葉黃酮，對影響提取效果的主要因素：料液比、乙醇濃度、回流溫度、回流時間進行四因素三水平的正交試驗。以黃酮的提取率為考察指標(biāo)，結(jié)果見表2。

由表2極差分析結(jié)果可知，4個因素對黃酮提取率的影響大小依次為：回流時間＞乙醇濃度＞回流溫度＞液固比，最佳組合為A3B2C2D3，即料液比為1∶30（g/mL），乙醇濃度為70%，回流溫度為70℃，回流時間為120min。

2.2.2驗證性試驗

為進一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，在上述最佳條件下，進行3次平行試驗。用紫外分光光度法測定其吸光度，并計算出黃酮類物質(zhì)浸出率最高，為2.917%。

2.3竹葉黃酮清除DPPH自由基能力

采用清除DPPH自由基的能力，測定竹葉黃酮抗氧化活性，結(jié)果如圖5所示。

表2　正交試驗結(jié)果Table 2　Orthogonal test design and results

圖5　 竹葉黃酮對DPPH自由基清除的能力（n=3）Fig.5　Scavenging ability of flavone from bamboo leaf

在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，竹葉黃酮清除自由基的能力與樣品濃度具有較好濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系。擬合方程為Y=0.131 4C+23.225（R2=0.997）。

2.4竹葉黃酮抗氧化穩(wěn)定性

2.4.1pH對竹葉黃酮抗氧化穩(wěn)定性的影響

取等體積（5 mL）質(zhì)量濃度為200 μg/mL的竹葉黃酮溶液6份，分別置于6個小燒杯中，用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)整pH為2、6、7、8、10、12。室溫下放置2h后，取樣測定其對DPPH自由基的清除率，見圖6所示。

圖6　pH對竹葉黃酮清除DPPH自由基的影響Fig.6　Effect of pH on antioxidant stability of flavone from bamboo leaf

在圖6中，竹葉黃酮的抗氧化能力在pH=6時最強。隨著pH降低，即酸性增強，黃酮對DPPH自由基的清除率降低，這是因為黃酮在酸性條件下形成烊鹽，致使其抗氧化能力降低。堿性條件下，竹葉黃酮DPPH自由基清除率下降更為迅速，pH=12時，清除率僅為33.7%，這主要因為堿性條件下，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中所含酚羥基被破壞，而導(dǎo)致抗氧化活性降低。

2.4.2光照對抗氧化穩(wěn)定性的影響

光照對抗氧化穩(wěn)定性的影響見圖7。

圖7　 光照對竹葉黃酮清除DPPH自由基的影響Fig.7　Effect of light on antioxidant stability of flavone from bamboo leaf

由圖7可知，光照對竹葉黃酮清除DPPH自由基能力有較大影響。隨著光照時間的延長，清除率幾乎成直線減弱；在光照12 d后下降至45.1%。光照試驗前后，清除率下降達接近一半；而未光照樣品的對照組，清除率下降較少。這是因為竹葉黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中的多含有酚羥基，光照下易被氧化，從而導(dǎo)致其抗氧化性減弱。

2.4.3金屬離子對抗氧化穩(wěn)定性的影響

金屬離子對抗氧化穩(wěn)定性的影響見表3。

表3　金屬離子對竹葉黃酮清除DPPH自由基的影響Table 3　Effect of metal ions on antioxidant stability of flavone from bamboo leaf

從表3可看出，不同金屬離子在相同的濃度下，對竹葉黃酮清除DPPH自由基的作用區(qū)別較大。其中，Na+對抗氧化活性影響最??；Mg2+、Ca2+對抗氧化活性影響處在中間位置；而Zn2+、Cu2+、Al3+的影響較大，特別是Al3+影響最為嚴(yán)重。這可能與黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中所含酚羥基或羰基，易與某些金屬離子進行絡(luò)合致使其性質(zhì)發(fā)生改變，從而降低了抗氧化活性。金屬離子不同，配位能力也不同，從而表現(xiàn)出其對抗氧化能力的影響區(qū)別較大。

3　結(jié)論

以漢中產(chǎn)毛竹鮮竹葉為原料，經(jīng)超聲波預(yù)處理-乙醇回流法對竹葉黃酮進行提取，得到最佳提取工藝是料液比為1∶30（g/mL），乙醇濃度為70%，回流溫度為70℃，回流時間為120 min時，竹葉黃酮提取率最高為2.917%。通過清除DPPH自由基法測定竹葉黃酮的抗氧化活性，研究不同條件下黃酮抗氧化穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，3種金屬離子Na+、Ca2+、Mg2+對竹葉黃酮清除DPPH自由基的能力影響不大；而金屬離子Cu2+、Zn2+、Al3+以及pH、光照時間對抗氧化能力影響較大。因此，在對竹葉黃酮的制備和使用過程中，應(yīng)避免強酸、強堿、強光條件下保存；同時要注意避免與一些高濃度金屬離子Cu2+、Zn2+及Al3+的接觸。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.013

基金項目：國家自然科學(xué)基金（21373132）

作者簡介：史娟（1978—），女（漢），副教授，博士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)和有機合成。

收稿日期：2015-05-04

Extraction of Flavone from Bamboo Leaf of Hanzhong and Their Antioxidant Stability

SHI Juan，LI Jiang，GE Hong-guang

（School of Chemistry and Environment Science，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，Shaanxi，China）

Abstract：The extraction process of flavone in bamboo leaf from Hanzhong assisted by ultrasonic wave pretreatment was studied.The flavone extraction from the different solid-to-liquid ratio，ethanol concentration，extraction temperature and extraction time were studied.And the antioxidant stability of flavone was assessed by its capacity to scavenge the DPPH free radical under different treatments.The results showed that the best extraction process condition was：the ratio of solid to extracting liquid 1∶30（g/mL），ethanol concentration 70%，abstracting temperature 70℃and abstracting time 120 min.The results of anti-oxidant activities showed that pH，illumination and metal ions（Cu2+，Zn2+，Al3+）had a bigger influence to the antioxidation stability of flavones.The metal ions Na+，Ca2+，Mg2+did not produce a great a reduction of scavenging capacity.

Key words：bamboo leaf；flavone；extraction；antioxidan；stability