單增李斯特菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的建立及其毒力基因在分離菌株中分布

劉二龍，袁慕云，呂英姿，陳　穎，王　娉，許龍巖，李嘉琪，鄭高彬，杜雅萍，林學(xué)勤

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單增李斯特菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的建立及其毒力基因在分離菌株中分布

劉二龍1，袁慕云2，呂英姿1，陳穎3，王娉3，許龍巖2，李嘉琪1，鄭高彬1，杜雅萍1，林學(xué)勤1

1.黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣州510730；2. 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣州510623；3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100025

摘要:目的建立同時(shí)檢測單增李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)溶血素基因hlyA、內(nèi)化素基因inlA和磷脂酶C基因plcB的TaqMan-MGB三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，并對101株單增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB基因進(jìn)行了檢測，分析3個(gè)毒力基因在多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)聚類群組中的分布情況。方法根據(jù)單增李斯特菌毒力基因hlyA、inlA和plcB的保守序列設(shè)計(jì)引物和小溝結(jié)合物(minor groove binder,MGB)探針建立三重?zé)晒釶CR方法，對其特異性、靈敏度和可重復(fù)性進(jìn)行了測試，并對分離的101株單增李斯特菌進(jìn)行三重PCR檢測。結(jié)果建立的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異于單增李斯特菌的檢測，重復(fù)性良好，組內(nèi)Ct值變異系數(shù)均小于1.5%,靈敏度可達(dá)100 CFU/mL。對101株單增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB的檢出率分別為98%、75%和98%。在可被MLST分型的89株菌株中，groupI的30株菌株有20株均缺失inlA基因；groupII的57株菌株中有56株三個(gè)基因均檢出;groupIII的菌株hlyA、inlA和plcB三個(gè)基因均未檢出。結(jié)論本文建立的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法能準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的檢測單增李斯特菌，101株單增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB三個(gè)毒力基因的檢出情況與單增李斯特菌的MLST分型聚類有較一致的關(guān)系，對分析單增李斯特菌毒力的強(qiáng)弱有重要參考意義。

關(guān)鍵詞:單增李斯特菌；TaqMan-MGB三重實(shí)時(shí)熒光PCR;毒力基因分布; 多位點(diǎn)序列分型

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種革蘭氏陽性胞內(nèi)寄生菌，主要引起成人敗血癥和新生兒腦膜炎等疾病，報(bào)道顯示，美國每年大約有2 500例單增李斯特菌病患者，占總住院人數(shù)的4%,但死亡人數(shù)占食源性致病病例的28%[1-3]。

傳統(tǒng)的單增李斯特菌分離鑒定方法無法滿足單增李斯特菌高通量快速檢測的需求。本文根據(jù)單增李斯特菌的溶血素基因hlyA、內(nèi)化素基因inlA和脂酶基因plcB的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物探針，建立了基于小溝結(jié)合物(minor groove binder,MGB)探針的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，探針的5′端采用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM、VIC和NED)標(biāo)記，3′端增加的MGB基團(tuán)，使探針結(jié)合靶序列的嚴(yán)謹(jǐn)度和檢測的分辨率均得到提高[4]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源本研究共選用單增李斯特菌菌株101株，其中100株菌株為廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心和中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院分離保存，所有菌株重新經(jīng)API listeria確認(rèn)為單增李斯特菌。另1株為單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC19115)。其他供試菌株為：英諾克李斯特菌(ATCC 33090)、伊氏李斯特菌(ATCC19119)、表皮葡萄球菌(CMCC 26069)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC(B)50115)、非01霍亂弧菌(Vb0)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、弗氏檸檬酸桿菌(ATCC43864)均購自陸橋生物技術(shù)公司。

1.1.2主要試劑Premix Ex TaqTM(TaKaRa)DNA marker(TaKaRa)。(大連寶生物工程有限公司)，腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion broth, BHI)(北京陸橋技術(shù)股份有限公司),堿性蛋白胨水(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)。

1.1.3主要儀器ABI7500熒光PCR儀(ABI)；12GC全自動(dòng)核酸純化系統(tǒng)(precision system science)；CT15RE高速冷凍離心機(jī)(HITACHI)；ND2000C微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific)；生化培養(yǎng)箱(德國Binder)。

1.2方法

1.2.1菌株模板制備取37 ℃過夜培養(yǎng)菌液1 mL置2 mL離心管離心去培養(yǎng)基后，用1 mL去離子水漂洗，12 000 r/min離心2 min去上清，重復(fù)2次。最后加200 μL去離子水在核酸提取儀上提取DNA備用。

1.2.2引物和探針設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank公布的單增李斯特菌hlyA，inlA,plcB基因的保守序列，采用ABI primer express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物及MGB探針，具體序列見表1，委托英濰捷基公司合成。使用前將引物和探針稀釋成20 μmol/L,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立及優(yōu)化以單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19115為陽性模板，優(yōu)化后反應(yīng)體系(30 μL)如下：Premix Ex TaqTM(2×)15 μL、hlyA、inlA、plcB引物探針(20 μmol/L)分別為0.5 μL、ROX0.3 μL、去離子水8.2 μL、DNA模板為2 μL。反應(yīng)條件：Stage 1：預(yù)變性95 ℃ 30 s；Stage 2：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，并于FAM、VIC，NED 3個(gè)通道收集熒光信號；擴(kuò)增反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行。結(jié)果判斷：待測基因出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，且Ct值<36,則判斷為陽性；如果36

表1單增李斯特菌毒力因子hlyA、inlA、plcB引物和探針序列Tab.1Primers and probe sequences of virulence factors for Listeria monocytogenes

引物名稱引物序列(5'→3')擴(kuò)增長度bphlyA-FCCTCGGAGACT-TACGAGATATTTTG72hlyA-RGCAATGGGAACTCCTGGTGTThlyA-PFAM-AAGGTGCTACTTTTA-ACC-MGBinlA-FTAACAGACACGGTCTCGCAAA66inlA-RTCCCTAATCTATCCGCCTGAAGinlA-PVIC-AGATCTAGACCAAGTTA-CAAC-MGBplcB-ACCAGCAGCTCCGCATGA69plcB-RTCCGCGGACCAACTAAGTTTAplcB-PNED-ATCGACAGCAAATTA-MGB

1.2.4三重實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性試驗(yàn)按1.2.1提取單增李斯特菌、英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、非01霍亂弧菌、副溶血性弧菌、弗氏檸檬酸桿菌基因組DNA，用1.2.3建立的三重實(shí)時(shí)熒光PCR體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.2.5三重實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將初始濃度為3×108CFU/mL的單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液稀釋成1×108CFU/mL，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋成1×107CFU/mL～1×101CFU/mL，每個(gè)稀釋度取1 mL按1.2.1提取DNA，按1.2.3建立的三重實(shí)時(shí)熒光PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6三重實(shí)時(shí)熒光PCR可重復(fù)性試驗(yàn)選取10倍倍比稀釋1×107CFU/mL～1×101CFU/mL的單增李斯特菌菌液1 mL按1.2.1提取基因組DNA對本文建立的三重?zé)晒釶CR方法的可重復(fù)性進(jìn)行測試，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，通過對各次試驗(yàn)結(jié)果所得Ct值的變異系數(shù)進(jìn)行分析來評價(jià)三重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

1.2.7單增李斯特菌分離株毒力基因三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測及毒力基因分布對101株單增李斯特菌采用本文建立的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行毒力基因的檢測。并結(jié)合本課題組單增李斯特菌分離株MLST分類的結(jié)果(另文發(fā)表)，分析毒力基因在MLST聚類分群中的分布情況。

2結(jié)果

2.1三重實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果按1.2.4進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株可以同時(shí)檢測到hlyA、inlA和plcB3個(gè)基因，其它菌株3個(gè)基因均無明顯擴(kuò)增曲線。表明本方法與其他陰性菌無交叉反應(yīng), 本文所建立的探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法特異性良好，見圖1。

2.2三重實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作按1.2.5的靈敏度測試結(jié)果顯示，hlyA、inlA和plcB基因三重實(shí)時(shí)熒光檢測體系的最低檢測濃度達(dá)1×102CFU/mL，見圖2。采用1×107CFU/mL～1×102CFU/mL 6個(gè)稀釋度分別繪制hlyA、inlA和plcB標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.99、0.98和0.99，擴(kuò)增效率分別為106%、112%和110%，見圖3，表明檢測體系的3個(gè)基因擴(kuò)增效率和線性相關(guān)系數(shù)良好，可以滿足三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的要求。

1：單增李斯特菌；2-9：英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、非01霍亂弧菌、副溶血性弧菌、弗氏檸檬酸桿菌1：Listeria monocytogenes；2-9：Listeria innocua,Listeria ivanovii,Staphylococcus epidermidis,Staphyl-ococcus aureus,salmonella typhimurium,Vibrio cholerae,Vibrio Parahemolyticus,Citrobacter freundii圖1　單增李斯特菌的多重實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性測試Fig.1　Specificity test of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

1-7分別為：1×107CFU/mL,1×106 CFU/mL，1×105 CFU/mL，1×104 CFU/mL，1×103 CFU/mL，1×102 CFU/mL，1×101 CFU/mL圖2　多重實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度測試Fig.2　Sensitivity test of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

圖中示標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，相關(guān)系數(shù)R2值和擴(kuò)增效率E值。Standard curves，the correlation coefficient(R2)values and the amplification efficiency(E) values were shown in the figure.圖3　單增李斯特菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.3　Standard curves of triplex real-time PCR assay for detection of Listeria monocytogenes

2.3三重實(shí)時(shí)熒光PCR可重復(fù)性試驗(yàn)選取1×107CFU/mL～1×102CFU/mL的單增李斯特菌菌液提取模板進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，結(jié)果表明3種毒力基因的Ct值變異系數(shù)均在2%以下見表2，說明本文建立的三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。

表2三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測單增李斯特菌的可重復(fù)性測試Table 2Reproducibility of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

菌液濃度(CFU/mL)重復(fù)3次Ct值平均Ct值CV(%)123hlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcB1×10721.1021.0421.2521.3821.4121.4321.3221.5621.4221.2721.3421.370.691.250.471×10624.1924.5624.6224.7724.9824.8024.7025.1324.7824.5521.3421.371.291.190.401×10528.0128.6728.1528.2028.9228.2128.2528.9628.2428.1524.8924.730.450.540.161×10431.5032.4431.4132.0232.8831.631.9632.4931.7031.8328.8528.200.890.740.471×10335.3135.6435.0435.3936.0935.1235.4736.0235.0135.3932.6031.570.230.670.161×10238.4038.6138.5638.9139.3038.2938.5738.9337.8738.6338.9538.240.670.890.91

表3101株單增李斯特菌毒力基因三重實(shí)時(shí)熒光PCR毒力基因檢測結(jié)果及分布Tab.3The distribution of 3 virulence gene in 101 Listeria monocytogenes strains

ST型Sequencetypes菌株數(shù)NumberofstrainshlyA基因陽性菌株數(shù)PositivenumberofhlyAinlA基因陽性菌株數(shù)PositivenumberofinlAplcB基因陽性菌株數(shù)PositivenumberofplcBSTsUPGMA聚類群組STsalignedbyUPGMA1,3,4,5,59,73,87,201,218,330,456,517,New1,New2,New8,New9,New11,New14,New16,New17,New22,New23,New2530301030groupI7,8,9,14,19,34,98,101,121,122,155,307,343,New3,New4,New5,New7,New10,New13,New15,New18,New19,New20,New21,New24,New2657575657groupIINew6,New122000groupIIIUnidentifiedsequenctypes12121012unknown

*new1-new26為新發(fā)現(xiàn)的STs，尚待提交MLST網(wǎng)站后分配相應(yīng)的編號。

2.4單增李斯特菌毒力基因三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測及毒力基因分布應(yīng)用本文建立的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法對101株單增李斯特菌進(jìn)行了檢測，101株單增李斯特菌毒力基因分布情況及與MLST的聚類群的關(guān)系如表3所示。hlyA、inlA和plcB基因的檢出率分別為98%、75%和98%。其中89株按MLST進(jìn)行了分型，另12株因未獲得MLST要求的7個(gè)管家基因序列的完整片段而無法進(jìn)行MLST分型。

3討論

單增李斯特菌被世界衛(wèi)生組織列為重點(diǎn)監(jiān)測的食源性病原菌之一[5]。中國目前雖然未曾暴發(fā)人感染單增李斯特菌病，但多位研究者從各地多種食品中均分離出單增李斯特菌[6-7]，其風(fēng)險(xiǎn)性不容忽視。

單增李斯特菌毒力基因主要集中在兩個(gè)毒力島LIPI-1和LIP-2(又稱為內(nèi)化素小島)，其中hlyA、plcB屬于LIP-1，inlA屬于LIP-2[8-9]。hlyA基因是單增李斯特菌最重要的毒力基因，編碼的李斯特菌溶血素O(listeriolysin，LLO)是單增李斯特菌最重要的一種毒力因子，為細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞及幫助細(xì)菌逃脫吞噬泡所必需[10]。有研究顯示，缺失hlyA序列的單增李斯特菌無法入侵宿主細(xì)胞，對宿主無毒性[11-12]。InlA基因編碼內(nèi)化素，它與細(xì)菌的侵襲相關(guān)，位于菌體表面, 與特異性受體鈣黏蛋白(E-cadherin)結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)菌侵襲入細(xì)胞并內(nèi)化至吞噬小體,是建立感染的前提。有研究結(jié)果顯示，InlA/InlB基因雙缺失后，單增李斯特菌菌株的毒力明顯減弱[13-15]。于豐宇等有關(guān)小鼠毒力實(shí)驗(yàn)的LD50也顯示，內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是導(dǎo)致菌株毒力降低的原因,目前有關(guān)報(bào)道表明致病性的LM都含有inlA,inlB[16-17]。plcB編碼磷脂酰膽堿磷脂酶(PC-PLC)，是細(xì)菌在宿主細(xì)胞間擴(kuò)散并突破雙層膜時(shí)需要的關(guān)鍵因子之一，還可幫助單增李斯特菌逃離吞噬小體[18]。

本文101株單增李斯特菌菌株中hlyA基因、plcB基因檢出率均為98%。提示其在單增李斯特菌中毒力基因中占重要位置(除groupIII的兩株菌株未檢出hlyA基因、plcB基因外，其他菌株均有檢出)。inlA基因的共有25株菌株未檢出，占整個(gè)101株單增李斯特菌菌株的24.8%，其中的20株屬于groupI，占整個(gè)groupI中30株菌株的比例為67%(20/30)，提示groupI中缺失inlA基因的菌株比例較高。至于本文中單增李斯特菌菌株中inlA基因缺失株與inlA基因陽性菌株的毒力有無差異有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。

本課題組將101株單增李斯特菌菌株進(jìn)行了MLST分型分析，發(fā)現(xiàn)可將其中的1-89號共89株單增李斯特菌根據(jù)MLST分型并獲得相應(yīng)的STs,并聚類分成3個(gè)群組：groupI,groupII和groupIII(分別與血清型譜系lineageI,lineageII和lineageIII相對應(yīng))。序號1-57共57株單增李斯特菌屬于groupII(相應(yīng)于血清型分類的lineageII，)，除了序號44的菌株inlA基因陰性外，其余56株單增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB3個(gè)基因均為陽性；序號58-87共30株單增李斯特菌屬于groupI(相應(yīng)于血清型分類的lineageI，)，其hlyA、plcB均為陽性，但inlA基因陰性率較高(共20株，占67%)；序號88、89共2株單增李斯特菌屬groupIII(相對應(yīng)于血清型分類的lineageIII)，其3個(gè)毒力基因hlyA、inlA、plcB3個(gè)基因全部未檢出。對于序號90-101這12株菌株，本課題組發(fā)現(xiàn)因未能獲得MLST要求的7個(gè)管家基因的完整序列而能成功進(jìn)行MLST分型，但采用本文建立的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，除序號90號和序號101的菌株不能檢出inlA基因外，其他均可檢出hlyA、inlA、plcB3個(gè)毒力基因，且經(jīng)API listeria確認(rèn)為全部為單增李斯特菌，提示應(yīng)進(jìn)一步完善MLST的分型方法。

目前認(rèn)為單增李斯特菌具有13個(gè)血清型，可分為4個(gè)譜系，lineageI、lineageI、lineageIII 和lineageIV[19]。90%以上的李斯特菌病病例均由1/2a、1/2b、4b型引起，其中大多數(shù)暴發(fā)病例歸因于4b型。其中1/2b、4b屬lineageI，1/2a屬lineageII[20-23]。lineageIII和lineageIV譜系包含菌株數(shù)量很少，lineageIII血清型大多毒力較弱,很少引起發(fā)病[24]。在本次101株單增李斯特菌毒力基因的檢測中，除未能MLST分型的12株菌株(序號90-101)外，89株單增李斯特菌中有87株菌株均分布于lineageII(groupII)和lineageI(groupI)這兩個(gè)血清家系中，占比98%，且3個(gè)毒力基因均陽性的比例為75%,2個(gè)毒力基因均陽性的比例為98%，說明其毒力基因保持相對完整，具較強(qiáng)潛在致病力。其余2株(序號88-89)分布于groupIII (lineageIII)，結(jié)合其3個(gè)毒力基因均為陰性的結(jié)果表明，lineageIII中2株菌株的3個(gè)毒力基因均缺失，與lineageIII這一血清家系其毒力較弱的情況較為一致。此外從3個(gè)基因的檢出率顯示，groupII (lineageII)菌株陽性的毒力基因多于groupI (lineageI)的菌株,與其毒力強(qiáng)弱是否相關(guān)有待進(jìn)一步的研究。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.007

通訊作者：許龍巖，Email: xlyciq@126.com

中圖分類號：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-451-06

Corresponding author:Xu Long-yan,Email:xlyciq@126.com

收稿日期：2015-12-29修回日期：2016-02-03

Development of triplex TaqMan MGB-probe real-time PCR assay for detection ofListeriamonocytogenesand the distribution of virulence gene in isolates

LIU Er-long1,YUAN Mu-yun2,LU Ying-zi1,CHEN Ying3,WANG Ping3,XU Long-Yan2,LI Jia-qi1,ZHENG Gao-bing1,DU Ya-ping1,LIN Xue-qin1

(1.HuangpuEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510730,China；2.GuangdongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510730,China；3.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100025,China)

Abstract:To develop a sensitive and specific triplex TaqMan-MGB real-time PCR assay for the detection of Listeria monocytogenes isolated from animal derived food，specific primers and MGB probes targeted toward the hylA,inlA and plcB gene were designed based on the conserved sequences.Then,the virulence genes distribution among groups(groupI,groupII,groupIII) which aligned by Multilocus sequence typing (MLST)was analyzed. The results showed that the assay developed in this study has good sensitivity,specificity and repeatability for the detection of Listeria monocytogenes.The detection limit was 100 CFU/mL in pure culture.and the amplifying efficiencies and the correlation coefficient of standard curves were all in the acceptable ange.The positive rates of hylA,inlA and plcB were 98% (99/101),75% (76/101) and 98% (99/101) respectively in 101 Listeria monocytogenes strains. Among 89 of 101 strains classed into 3 clusters(groupI,groupII and groupIII) by MLST，20 of 30 isolates belonged to groupI were all negative in inlA gene;56 of 57 isolates belonged to groupII were positive in all 3 virulence gene；2 isolates grouped into groupIII which hlyA,inlA and plcB were all negative.The detection result showed that the distrubution of 3 virulence gene consistented with the type groups clustered by MLST and provided remarkable references value for evaluating the virulence of Listeria monocytogenes.

Key words:Listeria monocytogenes;TaqMan-MGB real-time PCR; distribution of virulence genes; Multilocus sequence typing Supported by Science and Technology Planning Project of Guangdong Province,China (No.2013B040402004)

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013B040402004)資助