崔玉花，田莉莉，王曉亮，姜海蓉，范偉興，彭方毅

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基于樣品檢測的布魯氏菌熒光定量PCR方法的建立

崔玉花1,2，田莉莉2，王曉亮3，姜海蓉1，范偉興2，彭方毅4

1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶400054；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島266110；3.寧夏回族自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏750000；4.重慶市墊江縣中醫(yī)院，重慶408300

摘要：目的本文建立一種基于樣品檢測的特異性好、靈敏性高的布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法。方法以哺乳動物beta-actin基因和外源重組質(zhì)粒為內(nèi)參，針對布魯氏菌屬特異性基因IS711，建立用于樣品檢測的布魯氏菌熒光定量PCR方法，并驗(yàn)證其敏感性、特異性及穩(wěn)定性，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將該方法用于哺乳動物樣品檢測，并與細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測結(jié)果比較。結(jié)果熒光定量PCR方法對布魯氏菌檢測有良好的特異性，3對引物對陰性對照菌均無非特異性擴(kuò)增；該方法用于樣品檢測的最低檢測限為17拷貝；內(nèi)外源內(nèi)參同時(shí)存在條件下，布魯氏菌熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為R2=0.997(Y=-3.12X+40.9)。將該方法直接用于181份動物樣本的檢測，并與分離培養(yǎng)結(jié)果相比，熒光定量PCR檢測陽性率為11.4%，細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測陽性率為9.9%，且細(xì)菌分離培養(yǎng)陽性樣品與熒光定量PCR陽性樣品中編號基本一致。結(jié)論本文建立的熒光定量PCR檢測方法靈敏性高、特異性及穩(wěn)定性好，可直接應(yīng)用于樣品的檢測，檢測結(jié)果受內(nèi)參基因質(zhì)控。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌；熒光定量PCR；外源內(nèi)參；內(nèi)源內(nèi)參

布魯氏菌病是由革蘭陰性菌布魯氏菌引起的一種全球性人獸共患病[1]。已有多篇文章報(bào)告用于布魯氏菌檢測的普通PCR方法的靈敏性比熒光定量PCR低，而且易造成產(chǎn)物污染[2-4]。

熒光定量PCR檢測方法靈敏性高、用時(shí)短且避免PCR產(chǎn)物污染，適用于直接檢測樣本中的布魯氏菌，Vladimira等人就研究了將熒光定量PCR方法用于組織、全血的布魯氏菌檢測方法[5]，也有多篇文獻(xiàn)報(bào)道將本方法用于人布魯氏菌病的診斷及愈后跟蹤[6-7]。但這些方法都沒有加入內(nèi)參來質(zhì)控檢測結(jié)果，因而無法判定是否出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。所以我們建立了一種含有內(nèi)參基因的直接應(yīng)用于樣品檢測的布魯氏菌熒光定量PCR方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株布魯氏菌：羊種16M、牛種544、豬1型、犬種；陰性參考菌：大腸桿菌O∶86、大腸桿菌O∶157、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O∶9、人蒼白桿菌、白色念球菌、傷寒沙門氏菌、發(fā)根土壤桿菌、綠膿桿菌。上述菌株菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑基因組DNA提取試劑盒、膠回收純化試劑盒購自天根公司；質(zhì)粒提取試劑盒、pMD19-T載體、qPCR Premix購自大連寶生物科技有限公司；DNeasy Blood & Tissue、QIAamp cador Pathogen Mini Kit購自QIAGEN公司。

1.1.3樣本來源動物子宮7份、脾9份；全血120份；奶樣45份。這些樣本均為中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存，并已在生物三級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行粉碎、滅活等預(yù)處理。

1.1.4引物及探針針對布魯氏菌屬特異性基因IS711設(shè)計(jì)引物及探針[8]。外源重組質(zhì)粒目的基因源于大西洋鮭魚β-球蛋白基因[9]。在熒光定量 PCR中，外源內(nèi)參重組基因與布菌屬目的基因的擴(kuò)增共用一對引物，其特異性探針：5′-NED-TGGCCACATACAAGTCACTGAGGA-BHQ1-3′。哺乳動物β-actin基因?yàn)閮?nèi)源內(nèi)參基因，引物及探針分別為r:5′-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3′; f:5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATG-3′; 探針:5′-VIC-G AGTCCGGCCCCTCCATCGTCCA -BHQ1-3′。上述引物及探針均由Life生物公司合成。

1.2方法

1.2.1DNA提取用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取布魯氏菌及其陰性參考菌DNA；用DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) 提取組織和全血的DNA，全血DNA提取之前，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心棄上清。如一次裂解不完全，可洗多次至紅色完全褪去[5,10]。奶樣DNA的提取用QIAamp cador Pathogen Mini Kit。

1.2.2布魯氏菌屬標(biāo)準(zhǔn)品制備常規(guī)PCR方法擴(kuò)增目的基因，并將PCR產(chǎn)物回收純化后導(dǎo)入克隆載體pMD19-T中。用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒后，紫外儀測其濃度及純度。得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為2.2×1010拷貝·μL-1。

1.2.3熒光定量PCR檢測體系的建立

經(jīng)條件優(yōu)化后的最優(yōu)反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積25 μL，包括2×PCR Primer mix 12.5 μL，布魯氏菌屬特異性基因引物1.25 μL，探針1.5 μL，外源及內(nèi)源性內(nèi)參探針0.5 μL，內(nèi)源內(nèi)參引物0.5 μL(各引物及探針的工作濃度均為10 μmol·L-1)，外源重組質(zhì)粒1 μL(0.1 pg)，布菌DNA 3 μL，ddH2O 2.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。

1.2.4特異性實(shí)驗(yàn)以組織、全血、布魯氏菌、外源內(nèi)參重組質(zhì)粒及陰性參考菌(大腸桿菌O∶86、大腸桿菌O∶157、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O∶9、人蒼白桿菌、白色念球菌、傷寒沙門氏菌、發(fā)根土壤桿菌、綠膿桿菌)DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，分別驗(yàn)證布魯氏菌、外源內(nèi)參、內(nèi)源內(nèi)參引物及探針特異性。

1.2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋成2.2×1010～2.2×100拷貝·μL-1。批內(nèi)檢測：選擇上述10倍梯度稀釋后濃度區(qū)間為2.2×107～2.2×104拷貝·μL-1的布菌標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)濃度重復(fù)5個(gè)孔。批間檢測：選擇相同DNA濃度區(qū)間，在不同時(shí)段做5次重復(fù)試驗(yàn)，比較組內(nèi)及組間的變異系數(shù)，檢測檢測方法的穩(wěn)定性。1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以上述10倍梯度稀釋好的布魯氏菌DNA為模板(2.2×107～2.2×100拷貝·μL-1)。標(biāo)準(zhǔn)曲線做三組：布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)品為DNA模板；布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)品和外源重組質(zhì)粒DNA為模板；布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)品和外源重組質(zhì)粒及內(nèi)源內(nèi)參DNA為模板。每反應(yīng)孔重復(fù)3次,進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.7熒光定量PCR檢測模擬樣本的靈敏性實(shí)驗(yàn)

將羊種16M布魯氏菌DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到的Ct值通過布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出其初始拷貝數(shù)為5.6×105拷貝·μL-1，用陰性組織DNA將其進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋成5.6×105～5.6×100拷貝·μL-1，作為模擬樣本。每個(gè)反應(yīng)孔加入3 μL樣品，每組重復(fù)三次，陰性組織DNA為陰性對照，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。1.2.8熒光定量PCR用于樣本的檢測為了評價(jià)所建立的熒光定量PCR方法用于樣本檢測的實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)分別以提取的組織、全血及奶樣DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR的檢測，并與細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果進(jìn)行對比。

2結(jié)果

2.1特異性檢測布魯氏菌屬特異性引物及探針特異擴(kuò)增了羊種、牛種、豬種1型及犬種布魯氏菌(圖A)，擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生典型的S型熒光曲線(Ct值分別為16.87、19.06、22.12、27.34)，蒼白桿菌、大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等陰性參考菌無非特異性擴(kuò)增；以脾2份、子宮2份、全血3份、奶樣2份為DNA模板時(shí)(圖B)，內(nèi)源內(nèi)參基因的擴(kuò)增有特異性熒光曲線產(chǎn)生(Ct值分別為18.28、19.37、18.63、20.97、17.26、19.10、19.45、18.30、18.46)，而布魯氏菌、外源重組質(zhì)粒及陰性參考菌的DNA模板沒有非特異性熒光曲線產(chǎn)生。

圖1　布魯氏菌熒光定量PCR特異性Fig.1　Specificity results of real-time PCR for Brucella

2.2重復(fù)性熒光定量PCR方法檢測組內(nèi)重復(fù)性及組間重復(fù)性，組內(nèi)變異系數(shù)在0.24%～0.76%之間，組間變異系數(shù)在0.57%～2.2%之間，組內(nèi)及組間變異系數(shù)均在合理的范圍內(nèi)，說明本檢測方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備根據(jù)Ct值及對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線：只擴(kuò)布魯氏菌DNA時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999(Y=-3.34X+42.85)；擴(kuò)增布魯氏菌DNA和外源重組質(zhì)粒時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.997(Y=-3.13X+40.50)；同時(shí)擴(kuò)增布魯氏菌及內(nèi)外源性內(nèi)參基因時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.997(Y=-3.12X+40.9)。說明在布魯氏菌屬特異性片段擴(kuò)增的過程中，加入的外源及內(nèi)源性基因?qū)z測結(jié)果沒有影響。

圖2　布魯氏菌熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of real-time PCR for Brucella

2.4模擬樣品的靈敏性檢測結(jié)果顯示，熒光定量PCR方法用于模擬樣本檢測的檢測限為17拷貝，且能夠產(chǎn)生良好的特異性擴(kuò)增曲線。

1～6. 5.6×105 DNA拷貝·μL-1～ 5.6×100 DNA拷貝·μL-11～6. 5.6×105 DNA copeis·μL-1～5.6×100 DNA copeis·μL-1圖3　布魯氏菌熒光定量PCR靈敏性Fig.3　Sensitivity results of real-time PCR for Brucella

2.5樣品檢測結(jié)果本實(shí)驗(yàn)共檢測181份樣品，在外源性內(nèi)參和內(nèi)源內(nèi)參基因擴(kuò)增參照下，成功檢測179份樣本。其中16份組織樣本中檢測出8份陽性樣本，分別是5份陽性子宮(Ct值分別為27.05、26.08、16.76、29.28、23.05)和3份陽性脾(Ct值分別為26.14、25.30、27.24)，1份脾組織內(nèi)源內(nèi)參DNA無擴(kuò)增，檢測結(jié)果無效，其余為組織陰性；45份乳樣中有8份陽性(Ct值分別為27.20、26.72、28.36、23.84、26.97、26.25、27.79、28.67)，內(nèi)外源性內(nèi)參基因擴(kuò)增顯示45份樣品檢測結(jié)果有效；120份全血樣本中有4份陽性樣品(Ct值分別為30.84、29.63、31.23、17.54)，1份全血樣本擴(kuò)增無效。熒光定量PCR檢測的陽性率為11.4%。檢測結(jié)果成立的條件是：空白及陽性對照成立；外源重組質(zhì)粒和內(nèi)源內(nèi)參基因的特異性擴(kuò)增成立； Ct值<34。細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測出的陽性樣本有：7份組織樣本，8份奶樣和3份全血樣本，檢測的陽性率為9.9%。細(xì)菌分離培養(yǎng)與熒光定量PCR檢出的陽性樣本編號基本相符，細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測的奶樣與全血的陽性樣本都與熒光定量PCR檢測陽性樣品相符；在組織樣品檢測中，有1份細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測為陽性的組織樣本，熒光定量PCR檢測結(jié)果無效。熒光定量PCR與細(xì)菌分離培養(yǎng)的檢測結(jié)果對比可知，熒光定量PCR檢測方法更靈敏一些，而且本方法簡單、高效、可靠。

本研究建立了一種基于布魯氏菌屬特異性基因IS711的直接檢測樣品的布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，本方法用于樣品檢測的檢測線為17個(gè)拷貝，且具有良好的穩(wěn)定性。布魯氏菌屬及內(nèi)參基因的特異性引物及探針對陰性對照菌均無非特異性擴(kuò)增。此方法的建立為不具備布魯氏菌分離鑒定條件的實(shí)驗(yàn)室提供了一種針對病原核酸的簡便檢測方法。

3討論

快速可靠的檢測方法是控制疾病蔓延的有效手段。對于布魯氏菌病的診斷，傳統(tǒng)血清學(xué)方法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，且易受主觀意識影響，判定結(jié)果多出現(xiàn)假陰性或假陽性。細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)菌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但其對實(shí)驗(yàn)人員及設(shè)備的要求較高。而PCR方法作為一種更靈敏、高效且省時(shí)省力的檢測方法，更適用于布魯氏菌病的檢測。而且PCR檢測方法不需要直接接觸病原，沒有被感染的風(fēng)險(xiǎn)。

相較于普通PCR方法，探針法熒光定量PCR的靈敏性更高[11-13]，特異性更好，而且不需要進(jìn)行凝膠電泳，防止了PCR產(chǎn)物交叉污染的可能。本文建立的熒光定量PCR檢測方法中加入的兩種內(nèi)參基因，其中以哺乳動物β-actin基因?yàn)閮?nèi)源內(nèi)參質(zhì)控DNA提取物，以外源重組質(zhì)粒作為外源性內(nèi)參質(zhì)控布魯氏菌DNA的PCR擴(kuò)增。當(dāng)外源重組質(zhì)粒有擴(kuò)增而內(nèi)源內(nèi)參基因無擴(kuò)增時(shí)，說明病料中提取DNA的過程不成功；當(dāng)內(nèi)源內(nèi)參基因有擴(kuò)增而外源重組質(zhì)粒無擴(kuò)增時(shí)，說明布魯氏菌目的基因IS711的PCR擴(kuò)增反應(yīng)有抑制。在可以直接檢測動物病料的同時(shí)也保障了該檢測結(jié)果的有效可靠性，減少假陽性、假陰性。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lu CP. Veterinary Microbiology[M]. China Agricul Ture Press. 5 Edition: 2013，68-69.

陸承平，獸醫(yī)微生物學(xué)[M].5版，北京：中國農(nóng)林出版社. 2013，68-69

[2] AL-ajlan H.H, Ibrahim A.S.S, AL-Salamah A.A. Comparison of Different PCR Methods for Detection ofBrucellaspp [J]. Pol J Microbiol 2011，60(1): 27-33.

[3] Kumar, Sanjay, Urmil T, et al. Rapid MμLtiplex PCR Assay for the Simultaneous Detection of theBrucellaGenus,B.abortus,B.Melitensis, andB.suis[J]. J. Microbiol. Biotechnol. 2011，21(1): 89-92

[4] Baddour MM, Alkhalifa DH. Evaluation of three polymerase chain reaction techniques for detection ofBrucellaDNA in peripheral human blood [J]. Can J Microbiol, 2008，54(5):352-357.DOI: 10.1139/w08-017.

[5] V. Hinic, B. Isabelle, T. Andreas, et al. IS711-based real-time PCR assay as a tool for detection ofRubellaspp. in wild boars and comparison with bacterial isolation andserology[J]. BMC Vet Res, 2009，5:22.DOI: 10.1186/1746-6148-5-22.

[6] C. Debeaumont, P. A. Falconnet, M. Maurin. Real-time PCR for detection ofBrucellaspp. DNA in human serum samples[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2005，24: 842-845.

[7] E Navarro，MJ Segura JC,Castano，JS.Use of Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction to Monitor the Evolution ofBrucellamelitensisDNA Load During Therapy and Post-Therapy Follow-Up in Patients with brucellosis[J]. Clin Infect Dis, 2006，42:1266-73.

[8] Bounaadja L, Albert D, Chenais B, et al. Real-time PCR for identification ofBrucellaspp.: A comparative study of IS711, bcsp31 and per target genes [J]. Vet Microbiol, 2009,137:156-164.DOI: 10.1016/j.vetmic.2008.12.023.

[9] Inga FS, J. Lawrence Dunn, Gregory JT et al. A multipliex real-time polymerase chain reaction assay with two internal controls for the detection ofBrucellaspecies in tissues, blood, and feces from marine mammals[J]. J Vet Diagn Invest, 2013,25:72-81. DOI: 10.1177/1040638712470945.

[10] Kattar MM, Zalloua PA, Araj GF, et al. Development and evaluation of real-time polymerase chain reaction assays on whole blood and paraffin- embedded tissues for rapid diagnosis of human brucellosis[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2007，59(1): 23-32.

[11] Hisham HA, Abdelnasser SS, et al. Comparison of different PCR methods for Detection ofBrucellaspp. in Human Blood Samples[J]. Pol J Microbiol, 2011，60(1): 127-133.

[12] Newby DT, Had TL,Roberto FF. Real-Time PCR Detection ofBrucellaabortus: a Comparative Study of SYBR Green I, 5′-Exonuclease, and Hybridization Probe Assays[J]. Appl Environ Microb, 2003，4753-4759.

[13] Wang Y, Wang ZL, Zhang YX, et al. Polymerase chain reaction-based assays for the diagnosis of human brucellosis[J]. Ann Clin Microbiol and Antimicrob, 2014，13:31.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.010

通訊作者：姜海蓉，Email: 704751214@qq.com；

中圖分類號：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-469-04

收稿日期：2015-07-18修回日期：2015-12-16

Development of real-time PCR method based on sample detection forBrucella

CUI Yu-hua1,2, TIAN Li-li2, WANG Xiao-liang4,JIANG Hai-rong1, FAN Wei-xing2, PENG Fang-yi4

(1.ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing400054,China;2.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao266110,China;3.NingxiaHuiAutonomousRegionAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Ningxia, 750000,China;4.DianjiangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing408300,China)

Abstract：A reliable and efficient real-time PCR method directly used for sample detection targeting the Brucella genus-specific IS711 gen was developped. The method also includes a target to a conserved region of the beta-actin gene to assess suitable of extracted DNA and a plasmid-based internal control to detect failure of PCR due to inhibition. We verified the sensitivity, specificity and stability of this method, and made the standard curve. The method was directly used for the detection of 181 ani-mal samples, and compared with the bacteria separating culture. The limit of simulated sample detection was 17 copies, The specificity of this real-time PCR method was no cross-reactivity with Escherichia coil O:086, Escherichia coil O:157, Yersinia enterocolitica O:9, Ochrobactrum anthro, Candida albicans stra, Salmonella typhimuri, Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonas aeruginosa. Standard curve of the three groups were made: only to Brucella standard products as template DNA; to Brucella standard products and exogenous recombinant plasmid reference DNA, Brucella standard products, exogenous recombinant plasmid and endogenous host gene. The correlation coefficient were 0.999% (Y=-3.34X+42.85), 0.997% (Y=-3.13X+40.50) and 0.997%(Y=-3.12X+40.9), respectively. The positive detection rate of 181 animal samples was 11.4% for real-time PCR and 9.9% for bacteria separating culture, and bacteria isolated culture positive samples were basically

consistent with the number of real-time PCR positive samples. Result showed that with the advantages of higher sensitivity and reliable, the multiple real-time PCR method could be used to rapid detecting theBrucellaqualitily.

Key words:Brucella; real time PCR; exogenous reference; endogenous reference Ningxia main zoonosis prevention and control key technology research and demonstration(no.2013ZZN30)

寧夏地區(qū)主要人獸共患病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與示范(No.2013ZZN30)資助