茶樹兩個Dof轉(zhuǎn)錄因子的分離及其在溫度脅迫中的響應(yīng)分析

李輝，黃蔚，劉志薇，王永鑫，吳致君，莊靜*

茶樹兩個Dof轉(zhuǎn)錄因子的分離及其在溫度脅迫中的響應(yīng)分析

李輝1，3，黃蔚2，劉志薇1，3，王永鑫1，3，吳致君1，3，莊靜1，3*

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇 南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室， 江蘇 南京 210095；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095

摘要：茶樹是一種重要的經(jīng)濟作物，溫度脅迫對茶葉生產(chǎn)影響較大。本研究以茶樹品種迎霜為實驗材料，克隆獲得2個編碼Dof轉(zhuǎn)錄因子的基因CsDof1和CsDof2。序列分析顯示，CsDof1含有1 389 bp，編碼463個氨基酸；CsDof2含有1 458 bp，編碼486個氨基酸。CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子都具有典型的鋅指結(jié)構(gòu)域，分別位于第133～195和124～186個氨基酸位點之間。對CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)、親/疏水性、二級和三級結(jié)構(gòu)分析顯示，兩者都是親水性蛋白且顯偏堿性?？臻g結(jié)構(gòu)分析顯示，CsDof1和 CsDof2均有 1個 α-螺旋，且Dof結(jié)構(gòu)域的位點完全相同，均有4個半胱氨酸殘基。實時定量PCR表明，CsDof1和CsDof2在不同茶樹品種、不同溫度脅迫下均能誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)呈現(xiàn)差異。

關(guān)鍵詞：茶樹；Dof轉(zhuǎn)錄因子；鋅指結(jié)構(gòu)；溫度脅迫；基因表達(dá)

茶樹［Camellia sinensis （L.） O. Kuntze］在我國主要分布于北緯18°～38°，東經(jīng)94°～122°之間的地區(qū)，是我國一種重要的經(jīng)濟作物［1］，富含茶多酚、植物堿、氨基酸、維生素、有機酸等有機化學(xué)成分［2］。茶樹具有喜溫怕寒的特性，高溫和低溫的交替變化會對茶樹生長造成一定程度的傷害，從而影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。

當(dāng)植物處于逆境脅迫時，轉(zhuǎn)錄因子能啟動抗逆基因的表達(dá)，在逆境信號傳遞過程中發(fā)揮重要的作用［3］。Dof（DNA binding with one finger）轉(zhuǎn)錄因子屬于鋅指蛋白家族，在植物中能夠參與逆境調(diào)控。Dof家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域中含有1個保守的CX2CX21CX2C基序，其中 4個Cys殘基與1個Zn2+共價結(jié)合形成 1個單鋅指C2C2結(jié)構(gòu)域［4］。Dof轉(zhuǎn)錄因子通常包含2個主要的結(jié)構(gòu)域，即位于N末端的保守DNA結(jié)構(gòu)域和位于C末端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域。植物中第1個Dof轉(zhuǎn)錄因子于1993年從玉米中被鑒定出來［5］，此后多種植物的Dof轉(zhuǎn)錄因子被分離出來，并進行了相應(yīng)的基因功能研究和家族分類［6］。對擬南芥全基因組序列Dof成員進行系統(tǒng)分析的結(jié)果表明，擬南芥Dof家族包括36個轉(zhuǎn)錄因子，分為A、B、C、D 4個亞家族［7］。Moreno-Risueno等［8］將擬南芥、水稻、大麥、綠藻、苔蘚、蕨類和裸子植物等七大代表物種的116個Dof成員進行系統(tǒng)分類后，得到A、B、C、D、E、F、G 7個亞家族。Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)能調(diào)節(jié)種子發(fā)芽，參與植物的光形態(tài)建成，調(diào)節(jié)植物新陳代謝并響應(yīng)逆境脅迫［9-12］。目前，對其他植物Dof轉(zhuǎn)錄因子研究較多，茶樹Dof轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)研究還鮮有報道。

本研究以茶樹品種迎霜為材料，克隆得到2個編碼茶樹 Dof轉(zhuǎn)錄因子的基因CsDof1和CsDof2，并研究了其理化性質(zhì)、進化樹、親水性/疏水性及三級結(jié)構(gòu)。通過實時定量PCR方法，對茶樹中CsDof1和CsDof2的組織特異性，以及溫度脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)進行了分析，以期通過分子生物學(xué)技術(shù)手段，研究茶樹Dof轉(zhuǎn)錄因子對溫度脅迫的響應(yīng)機制，挖掘與茶樹抗逆有關(guān)的基因，為提高茶樹溫度適應(yīng)能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、菌株和質(zhì)粒

供 試材 料 為 迎 霜 （ C. sinensis cv. Yingshuang）2年生扦插茶樹幼苗，種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所實驗大棚。供試材料生長環(huán)境溫度保持在25℃，土壤pH為5.6，空氣濕度（70±10）%。取迎霜幼嫩葉片進行RNA的提取和cDNA的合成，并以迎霜幼嫩葉片的cDNA作為克隆基因的模板。

選取長勢良好的云南十里香（C. sinensis cv. Yunnan Shilixiang）、安吉白茶（C. sinensis cv. Anji Baicha）、迎霜（C. sinensis cv. Yingshuang）茶苗，控制光照培養(yǎng)箱中濕度為75%，將茶苗進行溫度處理（4℃低溫和38℃高溫）0、1、4、8、24 h。取不同處理的茶苗幼嫩葉片，進行RNA的提取和cDNA的合成，用于實時定量PCR。

大腸桿菌菌株 DH5α由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所保存；質(zhì)粒載體 pMD18-T vector、Ex Taq聚合酶、DL maker 2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit、實時定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq Kit均購自大連TaKaRa公司；總RNA提取試劑盒Quick RNA Isolation Kit購自北京華越洋生物科技有限公司；引物合成和DNA測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；DNA回收試劑盒購自杭州維特潔公司。

1.2 總RNA的提取及cDNA合成

按照Quick RNA Isolation Kit試劑盒說明書提取茶樹云南十里香、安吉白茶、迎霜葉片的總 RNA，利用微量紫外檢測儀 NanoDrop測定RNA濃度。用Prime Script RT Reagent Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 茶樹CsDof1和CsDof2基因的克隆

基于實驗室茶樹品種迎霜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［13］，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計兩對引物，分別為CsDof1-F: 5'-ATGTCGGAATC AAAAGACCCT-3'，CsDof1-R: 5'-TGAGC TTTCATGGAAGTCAAG-3'和CsDof2-F: 5'-ATGTCGGAATCAAAAGACCCT-3'，CsDof2-R: 5'-TGAACTCTCATGGAAGTTGAA-3'。PCR擴增體系為20 μL：dd H2O 7 μL，Ex Taq酶10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。將迎霜葉片的cDNA作為克隆基因的模板。用12 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳后分離條帶，按照DNA回收試劑盒說明書回收 PCR產(chǎn)物，然后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。提取大腸桿菌菌液后送至南京金斯瑞公司測序。

1.4 序列分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）對 Dof核苷酸和蛋白序列進行搜索和預(yù)測保守域［14］；利用 MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［15］；利用Origin 6.0進行熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析及圖表繪制；利用DNAMAN和ExPASy網(wǎng)站（http://www.expasy.org）對氨基酸親水/疏水性進行分析以及多重序列比對；利用SOPMA網(wǎng)站（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa）進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測［16］；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型［17］用Swiss-Model（http://www.Swissmodel.expasy.org）構(gòu)建。

1.5 實時定量PCR反應(yīng)

利用 iQ?5 software和 iQ?5Real- time PCR System，按照SYBR Premix Ex Taq Kit試劑盒說明書進行實時定量PCR（Quantitative real time RT-PCR）操作。相對定量參照基因的ΔΔCT法［18］，表達(dá)差異等于2-ΔΔCT ，ΔCT=CT目標(biāo)基因-CT actin，ΔΔCT=（CT目標(biāo)基因-CT actin）處理組-（CT

目標(biāo)基因-CT actin）對照組。茶樹actin作為內(nèi)參基因，與目標(biāo)基因CsDof1和CsDof2一起擴增，它們的表達(dá)檢測引物分別為CsDof1-R-F: 5'-TTCAAAGGATGATGTTGGTAG-3'，CsDof1-R-R: 5'-GGAGGATAGAATGGCATAGGA-3'和CsDof2-R-F: 5'-CTCCGTGGTCGTACCCTTG-3'， CsDof2-R-R: 5'-TACAACCCCAATAAGGCGG-3'，及 ACTIN-F: 5'-CCATCACCAGAATCCAAGAC-3'，ACTIN-R: 5'-GAACCCGAAGGCGAATAGG-3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsDof1和CsDof2基因的克隆

以迎霜葉片 cDNA為模板，分別以CsDof1-F、CsDof1-R和CsDof2-F、CsDof2-R兩對引物經(jīng)PCR擴增得到2個1 400 bp左右的片段（圖1）。序列測定與分析表明，茶樹CsDof1和 CsDof2基因片斷分別為 1 389 bp 和1 458 bp，編碼463和486個氨基酸（圖2、圖3）。

2.2 茶樹CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的進化分析

茶樹 CsDof1和 CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的進化分析參考 Moreno-Risueno等［8］的 Dof轉(zhuǎn)錄因子家族分類方法完成。在 Plant transcription factor database（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn）下載擬南芥、毛果楊、水稻等物種的 101個Dof成員，與CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子進行同源性比對并繪制進化樹。結(jié)果（圖4）表明，CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子同屬于Dof轉(zhuǎn)錄因子家族中的A亞族。

2.3 茶樹CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序

列比對及理化性質(zhì)分析

圖1 克隆茶樹CsDof1和CsDof2基因Fig. 1 CsDof1 and CsDof2 genes from C. sinensis by PCR amplification

圖2 茶樹CsDof1的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 2 cDNA and their deduced amino acid sequences of CsDof1 in C. sinensis

利用BLAST-conserved domains search對茶樹CsDof1和 CsDof2轉(zhuǎn)錄因子進行保守域預(yù)測。結(jié)果如圖5-A和5-B所示，CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域分別在第 133～195和第124～186個氨基酸位點之間，且均屬于鋅指蛋白。通過Blast同源檢索與比對，將茶樹CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子與多個物種的Dof轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進行多重序列比對，結(jié)果顯示一致性為61.35%。在保守區(qū)域內(nèi)9個賴氨酸、6個精氨酸、5個脯氨酸、4個甘氨酸、4個天冬氨酸、4個半胱氨酸、3個絡(luò)氨酸、3個蘇氨酸、2個甘氨酸、2個苯丙氨酸和1個絲氨酸殘基完全保守。從圖 5-C可以看出，CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的zf-Dof結(jié)構(gòu)域很相似，氨基酸序列都存在CX2CX21CX2C基序形成的單鋅指結(jié)構(gòu)，且含有Cys殘基的保守結(jié)構(gòu)域，CsDof1和CsDof2都含有Dof結(jié)構(gòu)域的所有功能單元。

用ExPASy網(wǎng)站對CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子進行氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析（表1）。結(jié)果表明，CsDof1和CsDof2蛋白分別含有463和486個氨基酸，理論等電點分別為5.97和 5.70，分子質(zhì)量分別為 50.09 kDa和52.76 kDa。對其他植物 Dof轉(zhuǎn)錄因子進行氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，不同植物中Dof轉(zhuǎn)錄因子理論等電點存在差異，但基本處于 5.41～6.97，且堿性氨基酸數(shù)目普遍高于酸性氨基酸。

圖4 茶樹CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的進化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of CsDof1 and CsDof2 transcription factors in C. sinensis

2.4 茶樹CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的親/疏

水性分析

利用DNAMAN 6.0軟件對茶樹CsDof1 和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子進行疏水性/親水性分析。結(jié)果表明，茶樹 CsDof1和 CsDof2轉(zhuǎn)錄因子親水性最強的的位點分別是第 189位的賴氨酸（Lys）和第 180位的賴氨酸（Lys）（圖6-A）；疏水性最強的位點分別是第305位的纈氨酸（Val）和第236位的亮氨酸（Leu）（圖6-B），CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子均屬于親水性蛋白。

2.5 茶樹CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的二級和

三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

利用 SOPMA網(wǎng)站對茶樹 CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。結(jié)果表明，CsDof1由 13.17%的 α-螺旋（Alpha helix）、5.62%的β-折疊（Beta turn）、11.02%的延伸主鏈（Extended strand）和 51.20%的隨機卷曲（Random coil）組成；CsDof2由15.02%的α-螺旋（Alpha helix）、6.38%的β-折疊（Beta turn）、12.55%的延伸主鏈（Extended strand）和 66.05%的隨機卷曲（Random coil）組成。因此，CsDof1和CsDof2主要組成部分為隨意卷曲結(jié)構(gòu)、α-螺旋、延伸主鏈和 β-折疊。通過 Swiss-Model網(wǎng)站對CsDof1和CsDof2進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖7），CsDof1和 CsDof2具有相似的三級結(jié)構(gòu)，均有1個α-螺旋，在Dof結(jié)構(gòu)域中的位點完全相同，均有 4個半胱氨酸殘基，表示了 Dof轉(zhuǎn)錄因子特有的鋅指結(jié)構(gòu)。

圖5 茶樹CsDof1（A）和CsDof2（B）轉(zhuǎn)錄因子的保守域及與其他物種氨基酸序列的多重比對（C）Fig. 5 The conserved domains of CsDof1 （A） and CsDof2 （B） and alignment of relative amino acid sequences in C. sinensis and other plants （C）

表1 不同植物中Dof轉(zhuǎn)錄因子氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析Table 1 Comparison of amino acid sequences， physical and chemical characterizations of Dof transcription factors among different plants

圖6 茶樹CsDof1和CsDof2氨基酸序列親水（A）、疏水（B）性質(zhì)分析Fig. 6 Analysis of hydrophilicity （A） and hydrophobicity （B） of the deduced amino acid sequences of CsDof1 and CsDof2 in C. sinensis

圖7 茶樹CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 7 The tertiary structures of CsDof1 and CsDof2 in C. sinensis

2.6 茶樹CsDof1和CsDof2基因在高低溫脅迫下的表達(dá)情況

通過實時定量 PCR分別檢測 CsDof1和 CsDof2基因在經(jīng)過高溫（38℃）、低溫（4℃）2種處理后的云南十里香、安吉白茶和迎霜中的表達(dá)情況（圖8）。

圖8 3個茶樹品種中CsDof1和CsDof2在高低溫處理下的表達(dá)情況Fig. 8 Expression profiles of the CsDof1 and CsDof2 under high and low temperature stresses in three tea cultivars

從圖中可以看出，CsDof1和CsDof2經(jīng)不同處理后在 3個茶樹品種中的基因表達(dá)情況存在差異。4℃處理下，茶樹CsDof1和CsDof2在迎霜中的表達(dá)情況相似，均在處理 24 h后達(dá)到最大值，分別為對照組（0 h）的56倍和13倍；38℃處理下，CsDof1的表達(dá)量逐漸增加，在處理24 h后達(dá)到最大。在安吉白茶中，38℃處理下，CsDof1和CsDof2的表達(dá)量均表現(xiàn)出減少的趨勢，CsDof2表達(dá)量減少的程度比CsDof1更明顯；在4℃的處理下，CsDof1表達(dá)量先增多再降低再增多，CsDof1和CsDof2的表達(dá)量分別在處理24 h和 8 h后達(dá)到最大值，分別為對照組的5倍和3倍。當(dāng)云南十里香受到高溫脅迫時，CsDof2的表達(dá)量相對于對照組明顯增加；低溫脅迫下，CsDof1 和CsDof2的表達(dá)量均在處理24 h后達(dá)到最大值，與對照組相比變化明顯，分別為對照組的16和54倍。

3 討論

植物生長發(fā)育過程中會受到非生物逆境的影響，高低溫脅迫是重要的非生物脅迫因子之一。為了適應(yīng)非生物逆境脅迫，植物體內(nèi)形成了復(fù)雜的調(diào)控機制，而轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)不同逆境方面具有重要作用，其表達(dá)調(diào)控也進一步對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。因此，分析與逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子就顯得尤為重要。

本試驗克隆得到的CsDof1和CsDof2基因編碼的 Dof轉(zhuǎn)錄因子都具有 Dof的典型特征，含有1個由52個氨基酸組成，高度保守的 zf-Dof結(jié)構(gòu)域，在 Dof結(jié)構(gòu)域中存在CX2CX21CX2C基序形成的單鋅指結(jié)構(gòu)，這與Umemura等［4］的研究結(jié)果相吻合。對 CsDof1 和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子氨基酸組成成分、理化性質(zhì)、親水性/疏水性的分析結(jié)果顯示，CsDof1 和CsDof2均屬于親水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)主要表現(xiàn)為隨意卷曲和 α-螺旋結(jié)構(gòu)。在三級結(jié)構(gòu)中，兩個轉(zhuǎn)錄因子Dof結(jié)構(gòu)域中的位點完全相同，均有 1個 α-螺旋，都存在 4個半胱氨酸殘基。系統(tǒng)進化樹表明CsDof1和 CsDof2轉(zhuǎn)錄因子均屬于Dof家族里的A亞族，與毛果楊A(yù)亞族親緣關(guān)系最近。

安吉白茶、迎霜和云南十里香3個茶樹品種的熒光定量PCR分析結(jié)果表明，高低溫影響CsDof1和CsDof2的表達(dá)量，說明CsDof1 和CsDof2在茶樹溫度脅迫中具有調(diào)控作用。研究證明，在白菜中，4個 BraDof轉(zhuǎn)錄因子基因能夠在低溫下被誘導(dǎo)［19］。馬靜的研究也表明，白菜受高低溫處理后，BraDof表達(dá)量迅速升高［20］。本試驗中，3個不同茶樹品種經(jīng)過低溫處理后，CsDof1和CsDof2表達(dá)量都高于對照組，Dof轉(zhuǎn)錄因子可能在茶樹響應(yīng)低溫的過程中發(fā)揮著重要作用。

近年來的研究已表明，Dof轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控植物體內(nèi)多種生物學(xué)過程［8］。本文通過對CsDof1和CsDof2的分析，證明了它參與茶樹對高低溫的響應(yīng)，且在不同茶樹品種間表達(dá)量存在差異。為了進一步認(rèn)識 CsDof1和CsDof2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機制，還需要對其調(diào)節(jié)途徑和作用機理作進一步深入研究。本研究也說明，利用溫度脅迫響應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來提高茶樹對溫度脅迫的綜合抗性，是一種有潛力的分子育種途徑。

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中圖分類號：S571.1；Q51；P423

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）03-312-11

收稿日期：2015-08-04

修訂日期：2015-11-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金（31200520、31570691）

作者簡介：李輝，男，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。*通訊作者：zhuangjing@njau.edu.cn

Isolation and Expression Analysis of Two Temperature Responsive Dof Genes from Camellia sinensis

LI Hui1，3， HUANG Wei2， LIU Zhiwei1，3， WANG Yongxin1，3， WU Zhijun1，3， ZHUANG Jing1，3*
1. College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；2. State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；3. Tea Research Institute， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China

Abstract:Tea is an important economic crop. Tea production is affected by temperature factors. CsDof1 and CsDof2，which encode Dof transcription factors， were cloned from tea cultivar ‘Yingshuang’ ［Camellia sinensis （L.） O. Kuntze］. The nucleotide and amino acid sequences， phylogenetic tree and molecular models of the CsDof1 and CsDof2 were analyzed. The results showed that the CsDof1 and CsDof2 are 1389 and 1458 nucleotides in length，which encode 463 and 486 amino acids respectively. Typical zinc finger domains are present in both CsDof1 and CsDof2， from coden 133 to 195 and 124 to 186 respectively. The CsDof1 and CsDof2 were hydrophilic proteins. The three-dimensional structures of CsDof1 and CsDof2 indicated the presence of a highly conserved Dof domain with four cysteine residues. Quantitative real-time PCR analysis showed that CsDof1 and CsDof2 were induced by different temperature stresses and the expression profiles were different among tea cultivars.

Keywords:Camellia sinensis， Dof transcription factor， zinc finger， temperature stress， gene expression