黃先洲，林新堅(jiān)

（1.寧德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福安　355000；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福建福州　350003）

大杯蕈組織分離部位的優(yōu)選研究

黃先洲1，林新堅(jiān)2

（1.寧德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福安355000；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福建福州350003）

為了確定大杯蕈組織分離的最佳部位，同時(shí)也為人工制種提供依據(jù)，對(duì)大杯蕈子實(shí)體4個(gè)不同組織分離獲得的菌絲進(jìn)行生長(zhǎng)量、抗逆性和抗污染能力測(cè)定試驗(yàn)。經(jīng)綜合比較分析，結(jié)果表明，菌柄中上部組織是大杯蕈母種組織分離的最佳選擇。

大杯蕈；組織分離部位；菌絲生長(zhǎng)量；抗逆性；抗污染

0　引言

大杯蕈（Clitocybe maxima） 又名大杯傘，大漏斗菌，隸屬于口磨科 （Trichlilmataceae），杯傘屬（Clitocybe）［1］，味道鮮美、香味獨(dú)特，是高溫淡季豐富食用菌市場(chǎng)的珍稀菌類(lèi)，有良好的發(fā)展前景。本試驗(yàn)對(duì)大杯蕈不同部位組織進(jìn)行分離獲得菌絲，并對(duì)其生長(zhǎng)量、生長(zhǎng)勢(shì)，以及抗不良環(huán)境能力和抗雜菌污染能力進(jìn)行了系列試驗(yàn)，以探求大杯蕈最佳的組織分離部位。

1　試驗(yàn)材料和方法

1.1供試菌株

新鮮大杯蕈優(yōu)質(zhì)子實(shí)體，無(wú)菌操作挑取子實(shí)體不同部位綠豆大小的內(nèi)部組織，接入PDA試管培養(yǎng)基斜面中央，27℃下室溫培養(yǎng)菌絲，純化轉(zhuǎn)管后分別獲得A，B，C，D 4個(gè)供試菌株。

子實(shí)體分離部位選擇與標(biāo)記見(jiàn)圖1。

1.2供試培養(yǎng)基

圖1　子實(shí)體分離部位選擇與標(biāo)記

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，水1 000 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g［2］。

固體培養(yǎng)基：木屑39%，棉籽殼34%，麥麩22%，玉米粉3%，葡萄糖1%，輕質(zhì)碳酸鈣1%，含水量65%［3］。

1.3供試接種塊置備

在PDA培養(yǎng)基滅菌后，取40 mL倒入250 mL的錐形瓶中，水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)自然冷卻，凝固成PDA平板培養(yǎng)基，冷卻后中央接種供試菌株，27℃室溫培養(yǎng)14 d，統(tǒng)一在菌落外緣用直徑5 mm打孔器打孔，獲取無(wú)誤差的供試接種塊。

1.4不同組織分離部位的菌絲生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn)

1.4.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素4個(gè)水平4個(gè)重復(fù)設(shè)計(jì)。即選用固體培養(yǎng)基，接種A，B，C，D 4種供試菌株，27℃室溫培養(yǎng)，劃線法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量［4］。

1.4.2試驗(yàn)方法

將配制好的培養(yǎng)料稱(chēng)取42 g，等量填入25 mm× 200 mm試管內(nèi)，共計(jì)20根。取略小于管口的小木棒統(tǒng)一向下壓實(shí)4.5 cm，以保證每根試管內(nèi)培養(yǎng)基有相同的松緊度。再抽出木棒，洗凈管口，擦干，塞上棉花塞，置于手提高壓鍋中進(jìn)行滅菌，壓力為0.15 kPa，滅菌時(shí)間維持1 h。培養(yǎng)基冷卻后，用大小一致、菌絲密度一致、菌齡一致的供試接種塊接種，菌絲長(zhǎng)滿料面后劃起始線，以后每隔3 d在菌絲先端劃一次走菌線，測(cè)量15 d的走菌長(zhǎng)度。

1.5不同部位組織分離菌株的生長(zhǎng)勢(shì)比較試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)、培養(yǎng)基制備與接種培養(yǎng)，方法與1.4相同，除對(duì)不同供試菌株生長(zhǎng)量測(cè)定外，還比較了生長(zhǎng)勢(shì)。生長(zhǎng)勢(shì)是根據(jù)菌絲萌發(fā)的快慢、菌落生長(zhǎng)的形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)的密度、色澤和均勻程度，按+++（優(yōu)：表示菌絲生長(zhǎng)整齊、純白、濃密）、++（良：表示菌絲生長(zhǎng)不齊、純白、較密）、+（差：表示菌絲生長(zhǎng)不齊、淡白、稀疏）三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行直觀評(píng)判。

1.6不同部位組織分離菌株的抗逆性比較試驗(yàn)

1.6.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雙因素試驗(yàn)，因素1設(shè)4個(gè)水平，即接種A，B，C，D 4種供試菌株；因素2也設(shè)4個(gè)水平，即選擇21，24，30，33℃4種菌絲生長(zhǎng)不良的溫度條件，恒溫培養(yǎng)菌絲；設(shè)置4個(gè)重復(fù)。劃線法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量。

1.6.2接種與培養(yǎng)

培養(yǎng)基制備、接種與生長(zhǎng)量測(cè)定方法與1.4相同，將試管按設(shè)計(jì)要求分別放入21，24，30，33℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.6.3抗逆性評(píng)估

接種塊萌發(fā)后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，主要根據(jù)大杯蕈菌株在各種逆境溫度下的生長(zhǎng)量，結(jié)合菌絲色澤、濃密程度等生長(zhǎng)勢(shì)差異，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.7不同部位組織分離菌株的抗污染試驗(yàn)

1.7.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雙因素試驗(yàn)，因素1設(shè)4個(gè)水平，即接種A，B，C，D 4種供試菌株；因素2也設(shè)4個(gè)水平，即細(xì)菌、鏈孢霉、青霉、綠色木霉4種染菌培養(yǎng)基；設(shè)置5個(gè)重復(fù)。劃線法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量。

1.7.2含雜菌培養(yǎng)基制備

先配制PDA培養(yǎng)基，各取25 mL等量分裝25 mm×200 mm試管內(nèi)，121℃滅菌30 min，水平放置于水平臺(tái)上自然冷卻，無(wú)菌操作下棄除前端1 cm的培養(yǎng)基；分別取2 mL細(xì)菌、鏈孢霉、青霉和綠色木霉懸濁液注入試管內(nèi)，搖蕩使其布滿培養(yǎng)基表面，多余倒棄；用預(yù)先高壓滅菌備用的無(wú)菌棉花塞替換被培養(yǎng)液濕潤(rùn)的棉花塞，制成含菌PDA試管平面培養(yǎng)基。

1.7.3抗污染能力評(píng)估

分別在含菌PDA試管平面培養(yǎng)基上接種大小一致、菌絲密度一致、菌齡一致的A，B，C，D菌株供試接種塊，接種位置事先用記號(hào)筆劃線定位，然后置于27℃的恒溫箱中培養(yǎng)3 d，接種塊萌發(fā)后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，根據(jù)大杯蕈菌株在各種含雜菌培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度、菌落大小、菌絲色澤、濃密程度等生長(zhǎng)勢(shì)和拮抗現(xiàn)象差異，劃分4個(gè)不同評(píng)分等級(jí)，即4分（耐）、3分（較耐）、2分（一般）、1分（差），進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［3］。

2　結(jié)果與分析

2.1不同組織分離部位的菌絲生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn)

不同組織分離部位菌絲的生長(zhǎng)量見(jiàn)表1。

表1　不同組織分離部位菌絲的生長(zhǎng)量　/cm

不同部位組織分離的菌株菌絲生長(zhǎng)量最大的是A菌株，其次是B，C菌株，D菌株最差。

組織分離母種菌絲生長(zhǎng)量的方差分析見(jiàn)表2。

表2　組織分離母種菌絲生長(zhǎng)量的方差分析

由表2可知，不同部位組織分離的菌株菌絲生長(zhǎng)量存在顯著差異。可見(jiàn)，大杯蕈母種組織分離部位的選擇，對(duì)菌絲生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用。

4種不同部位的差異顯著性（PLSD）法見(jiàn)表3。

由表3可知，A菌株與D菌株存在極顯著差異，與B菌株存在顯著性差異，與C菌株不存在顯著差異；C菌株與B，D菌株存在顯著性差異；B菌株與D菌株間不存在顯著性差異。綜上，A菌株即柄蓋交界處組織分離母種生長(zhǎng)量最大。說(shuō)明在適宜的溫度條件下，傳統(tǒng)組織分離獲得的菌株A表現(xiàn)效果最佳。

表3　4種不同部位的差異顯著性（PLSD）法

2.2不同部位組織分離菌株的生長(zhǎng)勢(shì)比較試驗(yàn)

接種后第5天進(jìn)行生長(zhǎng)量、生長(zhǎng)勢(shì)作比較。

大杯蕈不同部位組織分離母種的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。

表4　大杯蕈不同部位組織分離母種的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

由表4可知，在同批次試管的4個(gè)菌株中，以菌柄中上部?jī)?nèi)部組織分離的母種菌絲萌發(fā)較早，生長(zhǎng)較快，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)；柄蓋交界處組織的生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)勢(shì)次之。

2.3不同部位組織分離菌株的抗逆性比較試驗(yàn)

不同溫度條件下不同組織部位的菌絲生長(zhǎng)量見(jiàn)表5，菌株與溫度因素見(jiàn)表6。

表5　不同溫度條件下不同組織部位的菌絲生長(zhǎng)量

根據(jù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，進(jìn)行組織分離母種菌絲生長(zhǎng)量的方差分析。

組織分離母種菌絲生長(zhǎng)量的方差分析見(jiàn)表7。

表7　組織分離母種菌絲生長(zhǎng)量的方差分析

F測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，不同菌株間、不同溫度間菌絲生長(zhǎng)量都達(dá)到極顯著的水平，菌株×溫度的菌絲生長(zhǎng)量不存在差異，故需進(jìn)行多重比較。

2.3.1菌株間和溫度間菌絲生長(zhǎng)量差異的顯著性測(cè)驗(yàn)

菌株間和溫度間菌絲生長(zhǎng)量差異顯著性測(cè)驗(yàn)見(jiàn)表8。

表8　菌株間和溫度間菌絲生長(zhǎng)量差異顯著性測(cè)驗(yàn)

由表8可知，4個(gè)組織分離的菌株中B菌株與C，D，A菌株生長(zhǎng)量差異均達(dá)到極顯著水平；C菌株與A，D菌株生長(zhǎng)量差異達(dá)到極顯著水平；A菌株與D菌株不存在顯著性差異。B菌株的菌絲生長(zhǎng)量最高，C菌株的次之，A菌株的最低。由此可見(jiàn)，A菌株固然在適宜的溫度27℃下生長(zhǎng)量最大，但適應(yīng)的溫度范圍窄；B菌株則對(duì)21，24，30，33℃等逆境溫度均有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。

在4個(gè)溫度處理中，4個(gè)溫度間的菌絲生長(zhǎng)量差異均達(dá)到極顯著水平，但30℃的菌絲生長(zhǎng)量最高，其次是24，21，33℃菌絲生長(zhǎng)量最小。由此可見(jiàn)，大杯蕈菌株忍耐逆境高溫的能力要比耐低溫的能力弱，超過(guò)最適宜溫度后，生長(zhǎng)量下降幅度明顯快于即B菌株對(duì)溫度的抗逆性最強(qiáng)，菌株C次之，A菌株與D菌株最差。低于適宜溫度后的下降幅度。

2.3.2不同部位分離的菌株在逆境溫度下生長(zhǎng)量差異顯著性測(cè)驗(yàn)

各菌株在逆境溫度下生長(zhǎng)量差異顯著性見(jiàn)表9。

綜上所述，B菌株即菌柄中上部?jī)?nèi)部組織分離母種在4個(gè)溫度條件下生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)勢(shì)最佳。

表9　各菌株在逆境溫度下生長(zhǎng)量差異顯著性

2.4不同部位組織分離菌株的抗污染試驗(yàn)

正常生長(zhǎng)的大杯蕈菌絲純白，氣生菌絲較發(fā)達(dá)，先端生長(zhǎng)整齊。侵染雜菌后，與雜菌接觸部位或受侵染部分，大杯蕈菌絲均發(fā)生不同程度的色變，灰黃萎縮，失去原有特征。

2.4.1不同部位組織分離母種與綠色木霉的相互影響

綠色木霉侵染后，初期長(zhǎng)出灰白色纖細(xì)的菌絲，生長(zhǎng)緩慢。幾天后，灰白菌落上出現(xiàn)淡綠色粉狀分生孢子，菌落顏色由淡綠色轉(zhuǎn)變?yōu)闈饩G色，粉狀層加厚，受污染的菌絲發(fā)黃。4個(gè)不同部位母種菌絲體在試管中覆蓋綠色木霉菌落，二者不存在拮抗現(xiàn)象，但有逐漸被綠色木霉侵食的趨勢(shì)。兩者交界后第3天測(cè)其被侵食的平均長(zhǎng)度值。

大杯蕈不同部位組織分離母種與綠色木霉的相互影響見(jiàn)表10。

表10　大杯蕈不同部位組織分離母種與綠色木霉的相互影響

2.4.2不同部位組織分離母種與青霉的相互影響

母種菌絲體受青霉侵染后的癥狀與綠色木霉相似。初期出現(xiàn)白色或黃白色絨狀菌絲，1～2 d菌落便漸漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色粉狀霉層，局限生長(zhǎng)。凡有青霉污染的地方，菌絲生長(zhǎng)緩慢。4個(gè)不同部位母種菌絲在試管中覆蓋青霉菌落，二者不存在拮抗現(xiàn)象，但有逐漸被青霉侵食的趨勢(shì)。二者交界后第3天測(cè)其被侵食的平均長(zhǎng)度值。

大杯蕈不同部位組織分離母種與青霉的相互影響見(jiàn)表11。

表11　大杯蕈不同部位組織分離母種與青霉的相互影響

2.4.3不同部位組織分離母種與鏈孢霉的相互影響

鏈孢霉侵染后，初期生出呈絨毛狀的菌絲，其菌絲透明，有分枝和分隔且疏松，呈網(wǎng)狀，無(wú)色、白色或灰色，生長(zhǎng)后期呈粉紅色、黃色。大量分生孢子堆集成團(tuán)時(shí)，外觀與猴頭菌子實(shí)體相似。鏈孢霉的侵染能力比其他霉菌強(qiáng)，凡有鏈孢霉污染的地方幾乎不生長(zhǎng)。4個(gè)不同部位母種菌絲在試管中被鏈孢霉菌落覆蓋，二者不存在拮抗現(xiàn)象，并有逐漸侵食的趨勢(shì)。二者交界后第3天測(cè)其被侵食的平均長(zhǎng)度值。

大杯蕈不同部位組織分離母種與鏈孢霉的相互影響見(jiàn)表12。

2.4.4不同部位組織分離母種與細(xì)菌的相互影響

細(xì)菌侵染后，主要是培養(yǎng)基表面覆蓋一層黏液，生長(zhǎng)后期并無(wú)明顯的其他癥狀。4個(gè)不同部位母種菌絲在試管中覆蓋細(xì)菌菌苔，繼續(xù)生長(zhǎng)，二者不存在拮抗現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)10 d的觀察，通過(guò)劃線法量取生長(zhǎng)量，生長(zhǎng)量取各試管算術(shù)平均值。

大杯蕈不同部位組織分離母種與細(xì)菌的相互影響見(jiàn)表13。

2.4.5綜合評(píng)價(jià)

表12　大杯蕈不同部位組織分離母種與鏈孢霉的相互影響

表13　大杯蕈不同部位組織分離母種與細(xì)菌的相互影響

將上述4個(gè)不同組織部位母種對(duì)4種霉菌抗耐能力的得分分別統(tǒng)計(jì)，重復(fù)3次取算術(shù)平均值。A部位12.3分，B部位14.0分，C部位6.4分，D部位8.0分。以大于12分為好，8～12分為一般，小于7分為差，劃分為3個(gè)類(lèi)別。大于12分，即抗耐性比較好的有A，B部位；8～12分，即抗耐性一般的是D部位；小于7分，即抗耐性比較差的是C部位。結(jié)果研究認(rèn)為，大杯蕈對(duì)雜菌是具有一定的抗御能力。

3　結(jié)論與討論

（1）綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為選取成熟前大杯蕈子實(shí)體進(jìn)行組織分離母種所選的4個(gè)部位中，B菌株即菌柄中上部?jī)?nèi)部組織分離母種效果最佳。主要是因?yàn)锽菌株對(duì)21，24，30，33℃等逆境溫度均有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，并且在生長(zhǎng)勢(shì)和抗污染方面都優(yōu)于A菌株；而A菌株雖然在適宜的溫度27℃下生長(zhǎng)量最大，但適應(yīng)的溫度范圍窄。由此可見(jiàn)，常規(guī)法取菌柄與菌蓋交界處組織并非理想。

（2）在27℃溫度條件下，A菌株菌絲的生長(zhǎng)速度雖然快于B菌株，但在生長(zhǎng)勢(shì)、抗逆性、抗污染方面B菌株均優(yōu)于A菌株，因此大杯蕈菌種栽培特性的早期評(píng)判，是以菌絲生長(zhǎng)量為標(biāo)準(zhǔn)好，還是以菌絲生長(zhǎng)勢(shì)、抗逆性、抗污染等為標(biāo)準(zhǔn)好，是值得深入探討的問(wèn)題。本研究若有條件進(jìn)一步進(jìn)行出菇試驗(yàn)，將有助于澄清這一問(wèn)題。

（3）陳明杰等人［5］認(rèn)為，草菇組織分離物之間和出發(fā)菌株之間存在明顯的遺傳差異；王桂芹等人［6］認(rèn)為，平菇不同部位組織分離物栽培特性的明顯差異是由于低等生物組織細(xì)胞的隔膜上有大到足以讓細(xì)胞質(zhì)乃至多種細(xì)胞器移動(dòng)穿過(guò)的隔孔，致使不同組織部位的細(xì)胞在大小、原生質(zhì)濃度、細(xì)胞器數(shù)量、生理活性等方面都存在明顯差異所致。大杯蕈菌柄組織纖維化程度高，細(xì)胞小，內(nèi)含原生質(zhì)濃度低、細(xì)胞器數(shù)量少、生理活性差，為何再生的菌絲生長(zhǎng)更理想？這種情況在大杯蕈中有無(wú)普遍性，其他品種有無(wú)類(lèi)似表現(xiàn)？這些問(wèn)題均有待進(jìn)一步研究。

［1］黃年來(lái).中國(guó)食用菌百科 ［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993：119.

［2］黃毅.食用菌栽培 ［M］.第2版.北京：高等教育出版社，1998：217-228.

［3］暴增海，馬桂珍.不同雞腿蘑品種對(duì)霉菌抗耐能力的測(cè)定與分析 ［J］.中國(guó)食用菌，2001（2）：12-13.

［4］郝健，王永紅.平菇組織分離母種優(yōu)選部位試驗(yàn)初探 ［J］.延安大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999（4）：76-79.

［5］陳明杰，余智晟.草菇組織分離物的遺傳變異研究（Ⅱ）［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2000，7（2）：1-4.

［6］王桂芹，王秀艷.平菇子實(shí)體不同部位分離母種試驗(yàn) ［J］.食用菌，2002，24（1）：15-16.◇

Study on the Best Separates Position of Clitocybe maxima Organization

HUANG Xianzhou1，LIN Xinjian2
（1.Ningde Vocational and Technical College，F(xiàn)u'an，F(xiàn)ujian 355000，China；2.Soil and Fertilizers Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350003，China）

Test purpose lies in this study is to confirm the best separates position of Clitocybe maxima organization in order to offer artificially of making species.By culture of tissues separated from different four parts of Clitocybe maxima to make mother species，this study explored an experiment that against the bad environment and ability to resist pollution by measuring the growth volume of Clitocybe maxima's mycelium.Through comprehensive comparative analysis，the result indicates in four pieces of different position chosen，mother species separating from the top organization of the stem kind is the best choose.

Clitocybe maxima；separates position of organization；mycelium growth volume；against the bad environment；against pollution

S567.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.028

1671-9646（2016）06b-0005-05

2016-04-17

黃先洲（1982— ），男，碩士，講師，研究方向?yàn)椴枞~加工、食用菌。